植物组织培养报告四则.docx

（实验题目）开 题 报 告姓 名： 学 院（系、所）： 学 科 专 业： 导 师 姓 名：开 题 时 间： 论文题目中文垂吊矮牵牛再生体系的建立英文The establishment of petunias regeneration system论文工作计划简述（开题报告内容）1、本论文课题国内外概况和文献综述：矮牵牛 , 又名碧冬茄、灵芝牡丹, 属茄科矮牵牛属的多年生草本植物. 矮牵牛花大而色彩丰富, 是装饰花坛、街道的理想花卉, 广泛地应用于城市及园林绿化, 是世界上最普及,销售量最大的花卉之一1 .近年来矮牵牛在组织培养方面的研究发展很快,现将国内外研究概况分述如下。1.外植体的选择根据植物细胞全能性，理论上任何活组织在适宜的条件下都能发育成完整的植株。但是，在不同生长状况下、发育阶段、生长环境和不同部位的外植体存在一定的生理生化差异，因此选择不同的外植体课影响组织培养的形态发生。 分别以叶片、茎尖、茎段、种子、花蕾、花药等作外植体获得再生植株3-8 , 但从分化结果来看, 茎尖作外植体最好, 幼芽分化所需时间短，分化出来的幼芽健壮；其次为茎段，叶片不但产生愈伤组织少，而且产生幼苗所需时间长。在茎尖和茎段试验中，前者无论在生长势或分化率方面都优于后者.由于茎尖数量有限，而叶片培养时间长，因此以茎段（包括茎尖）作为外植体是矮牵牛组培的最佳选择。 2.培养基和培养条件的选择在基本培养基的选择上，主要用MS和1/ 2MS , 其中MS 主要用来培养愈伤组织及继代增殖, 1/ 2MS 主要用于生根培养.也有用N H 培养基 6 和1/ 4MS 培养基 9 对矮牵牛进行组培的. 针对不同的要求，可以改变基本培养基中的营养成分及其含量。目前为止, 大部分组织培养研究者都用6-BA 作为主要激素4 ,6 ,10-11 , 至于使用量, 不同的品种、不同的材料和不同的研究者得到了不同的结论.大部分研究者用BA或6-BA或NAA组合来诱导愈伤组织的产生，而且取得了良好的效果。一般BA在1.0-3.2mg/L之间，NAA在0.1-0.2mg/L之间都能获得大量的愈伤组织，最常用的是BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。也有用6-BA与IBA组合取得较好效果的。培养条件的选择上，目前普遍使用的条件为：PH值5.8，光照10-12h，温度20-28度，光照强度1000-2000lx。3.组培苗移栽技术组培苗移栽一般经过三个步骤：首先，当根长至1cm以上，苗高约4-5cm时在自然条件下打开瓶口开始炼苗，炼苗时间约2-3d或7-8d，然后把苗取出，用温水洗干净根部粘附的培养基，移栽至消过毒的无水基质中，适当遮阴并控制环境温度：10-20d后即可移栽大田或上盆。 虽然矮牵牛组织培养已经初步建立了快繁体系, 为市场幼苗的需求做出了一定贡献, 尚有许多问题值得继续研究. 如取材污染率高, 组织培养适应期长, 工厂化生产成本高等问题制约了矮牵牛组培苗工业化生产。2、本论文课题的理论和实际应用意义：基础理论：1）植物细胞全能性 2）细胞分化、脱分化与再分化 3）器官发生和胚状体发生实际意义：垂吊矮牵牛大面积栽培具有地被效果，景观瑰丽、悦目，具有很好的市场价值。植物组织培养以其繁殖系数大、繁殖周期短、有利保持亲本性状、成本较低、可周年进行生产等优点, 为在较短时间内大量生产花卉植物, 满足市场需求提供了可能. 应用组织培养技术对矮牵牛进行快速无性繁殖, 不仅可以保持其优良性状, 使花色纯化, 在短期内生产出大量整齐、均匀的健壮种苗, 还可以进行周年生产, 满足市场需求.3、论文的基本内容、结构框架以及要突破的难点：一、仪器及用品：试剂瓶、电子天平、烧杯、量筒、移液管、玻璃棒、容量瓶、培养皿、PH计、记号笔、高压灭菌锅、超净台二、配置培养基（1）MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L（2）MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L（3）MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L（4）壮苗培养基：MS（5）生根培养基：MS+IBA0.5mg/L上述培养基均为100ML固体培养基，2.5%蔗糖，0.85%琼脂，PH5.8三、材料与方法1.取材、消毒与接种取垂吊矮牵牛的幼嫩叶片及带顶芽的茎段，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗2-3遍，在超净工作台上用75%酒精浸泡30S，再用10%次氯酸钠溶液浸泡9min，用无菌水冲洗3次，用消毒滤纸吸干表面水分，将幼嫩叶片切成0.5*0.5左右大小，与带顶芽的茎段一起分别接种于（1）-（3）号培养基中培养，光照10-12h，温度20-28度，光照强度1400-1600lx2.快速繁殖 将已分化出芽的愈伤组织分割切小，转接入（1）号培养基中，可以获得大量的丛 生芽。 3.生根与移栽 将带有大量丛生芽的愈伤组织转入不含激素的MS培养基中，丛生芽不再增 殖，而是起到壮苗的作用，以利生根。当试管苗长到2cm左右时，切下转入生根培养基中。将生根的苗打开封口膜在室内炼苗1-2天，小心取出苗，转泥炭土栽培。 注意事项及难点：1）灭菌条件的度量,矮牵牛包被短毛，灭菌困难，易污染。 2）培养条件的控制。 3）干扰因素的排除。4、论文计划及进度：实验第一周，配置愈伤组织诱导所需的（1）-（3）三个梯度培养基。实验第二周，进行接种。实验第三周，将愈伤组织转接（1）号培养基，获取丛生芽。并配置4号MS培养基。实验第四周，将带有大量丛生芽的愈伤组织转接入4号培养基，进行壮苗培养。实验第五周，将试管苗转入生根培养基，进行生根培养。实验第六周，进行炼苗以及移栽。实验期间定期观察培养基凝固情况、是否长菌、愈伤组织生长情况，及时处理褐化、玻璃化等外植体。并做好观察记录，需记录的信息如下表日期培养箱条件观察结果处理事项备注5、主要参考文献： 1 瞿素萍. 矮牵牛的组织培养研究 . 西南农业大学学报, 2001 , 23 (05) : 4472448 3 王贤荣. 早樱种系的分类及其观赏价值.南京林业大学学报: 自然科学版, 2000 , 24 (06) : 44246 4 谢利锁. 野生早樱嫩枝扦插繁殖技术研究 . 林业科技开发, 2002 , 16 (02) : 20222 5 李继华. 扦插的原理和应用. 上海: 上海科学技术出版社, 1987 : 31233 6 王振师, 周丽华, 曾雷. 绯寒樱的扦插繁殖 . 中南林学院学, 2005 , 25 (03) : 82284 7 孟新法, 周维燕. 吲哚丁酸酸对苹果矮化砧离体快繁生根的影响 . 北京农业大学学报, 1982 , (02) : 25227 8 Dumano GH , Aygun AA , Gunes NT , et al. Effect of timing , IBA and Put rescine on rooting and shooting in Pyruselaeagri folia pall sof twood cuttings . Hort Sic , 1999 , 69 (11) : 1237 9 林伯年, 内昭作(日) , 沈德绪. 园艺植物繁育学M . 上海: 上海科学技术出版社, 1994 : 17710 Sagee O. Involvement of rooting factors and f ree IAA in the root ability of cit rus species stem cuttings . Hort Sci ,1992 , 51 (34) : 187219511 高新一, 王玉英. 植物无性繁殖实用技术 . 北京: 金盾出版社, 2003 : 74286 开题报告概况（包括单位、地点、出席人数及对论文工作计划提出的意见和建议）：指导教师意见：签名： 年 月 日指导组召集人意见：签名： 年 月 日植物组织培养实验报告一 实验目的让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。二 实验原理植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（ IAA ）和 6 苄基氨基腺嘌呤（ 6 BA ）的比例，决定了根和芽的分化。 三 实验器材（一）试剂 乙醇、IAA 或 2 ， 4 D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ） MS 培养基（二）仪器设备培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（ 100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等三 实验步骤1. 配制培养基（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ）。 （ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中按表 33 1 加入 IAA 和 6BA 。 吲哚乙酸先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。 2. 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 pH 5.8 ，趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中，每瓶约 20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中 121 （ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。3. 诱导产生愈伤组织 （ 1 ）取健壮的玫瑰、菊花茎数段，每段约 5 cm 长，于烧杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ，取出用无菌水洗 3 4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min ），用解剖刀切成 5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种 4 片，接种后扎好瓶口。 （ 2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在 25 温室中，每星期检查 l 2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶， 3 4 周后产生愈伤组织。（ 3 ）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放 1 2 块，仍培养在 25 温室中，每周 1 2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。四 实验结果 因为时间有限及实验严密性等问题，大部分都失败了，但是仍然有小部分分化发育了出来。已经证明了植物组织能够经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。植物组织培养实验报告一 实验目的让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。二 实验原理植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（ IAA ）和 6 苄基氨基腺嘌呤（ 6 BA ）的比例，决定了根和芽的分化。 三 实验器材（一）试剂 乙醇、IAA 或 2 ， 4 D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ） MS 培养基（二）仪器设备培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（ 100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等三 实验步骤1. 配制培养基（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ）。 （ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中按表 33 1 加入 IAA 和 6BA 。 吲哚乙酸先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。 2. 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 pH 5.8 ，趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中，每瓶约 20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中 121 （ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。3. 诱导产生愈伤组织 （ 1 ）取健壮的玫瑰、菊花茎数段，每段约 5 cm 长，于烧杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ，取出用无菌水洗 3 4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min ），用解剖刀切成 5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种 4 片，接种后扎好瓶口。 （ 2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在 25 温室中，每星期检查 l 2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶， 3 4 周后产生愈伤组织。（ 3 ）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放 1 2 块，仍培养在 25 温室中，每周 1 2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。四 实验结果 因为时间有限及实验严密性等问题，大部分都失败了，但是仍然有小部分分化发育了出来。已经证明了植物组织能够经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。植物组织培养实验及实习指导杨玲 编西南林学院生物技术教研室 目录实验一、母液的配制和保存2实验二、培养基的配制与灭菌.5实验三、外植体消毒与初代培养的建立.7实验四、继代与增殖培养.9实验五、生根培养11实验六、植物茎尖脱毒培养13实习 试管苗的炼苗与移栽.15 实验一、母液的配制和保存一、实验目的 通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。二、原理 配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液，浓缩20倍）、微量元素母液（母液，浓缩200倍）、铁盐母液（母液，浓缩200倍）和有机化合物母液（母液，浓缩200倍）等。三、实验材料、试剂和仪器设备1试剂NH4NO3, KNO3, CaCl22H2O, MgSO47H2O, KH2PO4, KI, H2BO3， MnSO44H2O, ZnSO47H2O, Na2MoO42H2O, CuSO45H2O, CoCl26H2O, Na2EDTA2H2O，FeSO47H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水2仪器设备冰箱，天平，酸度计或pH试纸，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(500ml，1000ml)，药勺、称量纸、酸度计或pH试纸，滴管、玻璃棒， 电炉，微波炉四、实验方法1.大量元素母液的配制配制时先用量筒量取蒸馏水大约800ml，放入1000ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。2.微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4 4H2O， ZnSO47H2O ，H2BO3 ，KI ，NaMoO42H2O， CuSO45H2O， CoCl26H2O，按制备母液的方法逐个溶解。（钼酸钠难溶解，可在室温下用蒸馏水溶解后再加入到微量元素母液中。）定容至1000ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。3.铁盐母液配制把FeSO47H2O和 Na2EDTA2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡12min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4冰箱中保存备用。4.有机化合物母液的配制按配方表中用量依次称取：维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。5.植物生长物质母液的配制NAA母液：准确称量10mg，先用少量1mol/LNaOH溶液完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为0.1mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。6-BA母液的配制方法相似，母液浓度为2mg/ml。请注意细胞分裂素的溶解方法。五、实验报告按照实验报告格式要求及各组在实验中的配制溶液情况，完成报告撰写。 附：MS培养基母液配方成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)母液母液NH4NO333000MnSO4 4H2O4460KNO338000ZnSO47H2O1720KH2PO43400H2BO31240MgSO47H2O7400KI166CaCL2 2H2O8800NaMoO42H2O50母液CuSO45H2O5肌醇20000CoCl26H2O5烟酸100维生素B1100母液甘氨酸400FeSO47H2O5560维生素B6100Na2EDTA2H2O7460 实验二、培养基的配制与灭菌一、实验目的 学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。二、原理组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。三、实验材料、试剂和仪器设备1试剂琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH2仪器设备天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，滴瓶，酸度计或pH试纸，培养瓶，封口膜，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，微波炉，电炉，标签纸，记号笔四、实验步骤1.培养基的配制培养基组成：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂(pH5.8) 将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液的用量如表1所示：母液名称母液浓度扩大倍数500ml培养基吸取量大量元素20微量元素200有机成分200铁盐200NAA0.1mg/ml6-BA2mg/ml 取50ml烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用各母液专用移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和生长物质母液，置于烧杯中备用。 取500ml烧杯一个，加入300ml蒸馏水，称量琼脂4g倒入烧杯中，将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂完全溶化后，加入15g蔗糖，充分溶解后，将准备好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素母液混合液倒入烧杯中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入500ml烧杯中，并加蒸馏水定容。 充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。 把培养基分装到广口瓶中，每瓶约50ml。用封口膜封好瓶口。贴上标签，注明培养基名称，配制者姓名和配制日期，待灭菌。2.培养基灭菌（灭菌条件：121，15分钟） 检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。 灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。 刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。要求：每人准备培养基2瓶。 提前准备实验三所需的无菌材料。五、实验报告附：稀酸和稀碱的配制方法1mol/LHCl取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。1mol/LNaOH称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。 实验三、外植体的消毒与初代培养的建立一、实验目的通过实验，初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。二、原理植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。三、实验材料、试剂和仪器设备1实验材料：月季当年生枝条2试剂：升汞，吐温-803.仪器设备（以各组所需为例）无菌器材：8瓶培养基 4个不锈钢托碟+吸水纸 1升无菌水 大号、中号镊子各2把 2把解剖刀、1把剪刀2个500ml烧杯非无菌材料： 0.1%升汞消毒液200ml1个250ml消毒缸 2盏酒精灯及火机1个1000ml搪瓷缸 (装废液用)1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml 1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、洗衣粉、喷雾器、鞋套、肥皂四、实验步骤1实验二制备的培养基即是本实验所用培养基。2接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。3选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好）。将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。3准备进入接种间，用肥皂水清洗双手至手肘部位并在自来水下冲洗干净，进入缓冲室后套上鞋套。4把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。消毒时间结束后在酒精灯火焰旁用无菌镊子将已完成表面灭菌的外植体转移到烧杯中，用无菌水清洗5次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒剂。最后一次清洗后将外植体转移到无菌托碟上，吸干水分备用。5将消毒后的外植体按极性方向接种到培养基上，每瓶可接入34段月季茎段。将培养瓶放置在212，光强8001200lx，光周期为12h的环境下培养。约30天长成具58片叶的无根试管苗。6各组的每位同学操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中，由下一位同学在使用前灭菌。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。五、实验报告1.接种2天后观察污染情况，计算污染率。污染率=污染的材料数/总接种材料数100%2.每周观察并记录外植体萌动的情况，包括外植体基部是否有愈伤组织出现及其出现时间，侧芽萌发时间及芽的生长状况（萌芽数及芽平均长度）等，并计算萌发率。并注意观察是否有芽玻璃化等异常情况出现。萌发率=侧芽萌发的茎段数/总接种材料数100%六、思考题为什么常在消毒液中加入12滴表面活性剂如吐温-80？ 实验四、继代与增殖培养一、实验目的通过实验，掌握运用植物生长调节物质调控植物器官分化的方法。二、原理以植物的茎、叶等作为外植体进行离体培养，可以直接诱导器官分化，产生芽、根，形成新的植物体；也可以诱导其改变原来的分化状态脱分化形成愈伤组织。这种愈伤组织在一定条件下，又能“再分化”出根和芽等器官。在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控着培养细胞再生完整植株的不同方式。三、实验材料、试剂和仪器设备1实验材料，实验三获得的月季无菌枝条2试剂MS母液，各种植物生长物质3仪器设备无菌器材：8瓶培养基34瓶46周龄月季无菌枝条4个不锈钢托碟+吸水纸 大号、中号镊子各2把 2把解剖刀非无菌材料： 1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球 1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml 2盏酒精灯及火机1个 橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套、肥皂1把大号镊子四、实验步骤1.培养基准备。增殖培养基，MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L； MS+6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L。2.接种室的灭菌见实验三。3.继代，将实验三的培养瓶转移到接种室，在将瓶放入超净工作台前用75%的酒精棉球擦拭瓶外表面，减少附在瓶外壁上的灰尘与微生物。然后在酒精灯火焰旁进行无菌操作，将无菌芽从原茎段上切下，切成12cm的带腋芽茎段转接到继代增殖培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽。4.培养，培养温度同于初代培养，将光强增至2000lx，光周期延长为16h/天，以免试管苗生长细弱。五、实验报告1.观察并记录月季茎段在增殖培养基上的生长和增殖情况，并计算增殖率（继代接种时的茎段数目与继代培养后所产生的茎芽数之比）。2.根据在两种培养基上的生长情况，确定最适增殖培养基。 实验五、生根培养一、实验目的同实验四。二、原理同实验四。三、实验材料、试剂与仪器设备1实验材料，实验四获得的月季试管苗2试剂MS母液，各种植物生长物质3仪器设备无菌器材：8瓶生根培养基34瓶810周龄月季试管苗4个不锈钢托碟+吸水纸 大号、中号镊子各2把 2把解剖刀非无菌材料： 1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球 1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml 2盏酒精灯及火机1个 橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套1把大号镊子四、实验步骤1.培养基准备。生根培养基，1/2MS+IBA0.5mg/L； 1/2MS+NAA0.5mg/L；1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。2.接种室灭菌。3.接种培养，在超净工作台上进行无菌操作。选取生长粗壮的无根苗，切成23cm的茎段，分别转入三种生根培养基中，于温度232，光强2000lx，光周期为12h的环境下培养。当幼苗基部伤口愈合，并出现白色根尖突出物时即可进炼苗和移栽管理。五、实验报告1.观察并记录月季无根苗在生根培养基上培养34周后的不定根发生情况，并计算生根率。生根率（%）=生根无根苗数/接种无根苗总苗数100%2.比较3种生根培养基的诱导效果。六、思考题植物芽和根的分化与植物生长调节物质有何关系？ 实验六、植物茎尖脱毒培养一、实验目的熟练掌握外植体表面消毒技术及茎尖剥离和培养的基本方法。二、原理病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，成熟的组织和器官病毒含量较高，而幼嫩的和未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点则几乎不含或含量很少。三、实验材料、试剂与仪器设备1.实验材料,盆栽菊花,万寿菊或矮牵牛种子2试剂MS母液，各种植物生长物质诱导培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+3%糖+0.7%琼脂，pH5.8增殖培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+3%糖+0.7%琼脂，pH5.8生根培养基：1/2MS+NAA0.1mg/L+珍珠岩3仪器设备无菌器材：4瓶诱导培养基4个培养皿+吸水纸 中号、小号镊子各2把 2把解剖刀、2把解剖针非无菌材料： 1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球 1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml 2盏酒精灯及火机1个 橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套旧牙刷、金刚砂、珍珠岩、小花盆（10cm）研钵1个、镊子2把、解剖刀1把、解剖镜1台四、实验步骤1.母株病毒的鉴定（汁液感染法），取母株叶片放于等体积（W/V）的缓冲液（0.1mol/L磷