茶叶内生菌的分离、脂肪酸鉴定及其生防功能初探.doc

8植物资源与环境学报 2007Journal of Plant Resources and Environment茶叶内生菌的分离、脂肪酸鉴定及其生防功能初探陈 璐，刘 波，蓝江林，苏明星，朱育菁收稿日期：2007-4-15基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2006AA10A211）作者简介：陈璐(1982)，女，福建泉州人，硕士生，实习研究员，主要从事生物技术和植物病害生物防治研究。通讯作者：朱育菁（1972），女，博士，副研究员，E-mail: （福建省农科院生物技术研究所，福建 福州 350003）摘 要：对采自有机茶生产基地和加工厂的“大白毫”和“福云六号”茶叶样品进行内生菌的分离、脂肪酸鉴定和抑菌谱测定。试验结果表明：从7份样品中共分离到16株细菌，1株真菌，没有分离到放线菌。老叶中均未检测到内生菌，芽叶中内生细菌数量为26.0139.5106cfu/g。同样是有机种植，“福云六号”芽叶的含菌量是“大白毫”的1.94倍。常规种植的“大白毫”的芽叶的含菌量为97.5139.5106cfu/g，明显高于有机种植的26.528.3%106cfu/g。杀青对有机种植“大白毫”芽叶内生菌含量没有明显影响，但却使常规种植芽叶的内生菌含量降低30.10%。“大白毫”带有红杆菌属（Rhodobacter）、微杆菌属（Microbacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）和贪噬菌属（Variovorax）这4个属的内生细菌。“福云六号”仅含有根瘤菌属和贪噬菌属。供试的15株菌中，有11株对供试10种病原菌表现出拮抗活性。放射根瘤菌Eb659号菌株有着最广的抑菌谱，能够抑制3种病原菌，番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果班病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌株，尤其是对西瓜果斑菌具有极好的抑菌效果，抑菌圈能达到53.00 mm，对于作为生防菌防治植物病害具有一定的应用和开发价值。关键词：茶叶；内生菌；分离；脂肪酸鉴定；生物防治 中图分类号： 文献标识码： 文章编号：Isolation, fatty-acid identification and the biocontrol potential of endophyte in theasienensis (Camellia sinensis) CHEN Lu, LIU Bo, LAN Jiang-lin, SU Ming-xing, ZHU Yu-jing (Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003，China) J. Plant Resour. & Environ2007Abstract：The isolation, fatty-acid identification and inhibition ability against pathogeny of endophyte in theasienensis (Camellia sinensis) were conducted. The theasienensis samples were collected from organic tea planting base and processing factory, and the varieties of the theasienensis were “DABAOHAO” and “FUYUNLIUHAO”. The results showed that 16 endophytic bacteria and 1 endophytic fungus were isolated from 7 theasienensis samples, while no actinomycete was found. Not any endophyte was detected in the old leaves, whereas the endophytic bacteria in the bud were 26.0-139.5106cfu/g. The endophyte in bud of “FUYUNLIUHAO” was 1.94 times higher than “DABAOHAO”, while both were treated with organ planting. However, the endophytes in “DABAOHAO” buds treated with normal planting were 97.5-139.5106cfu/g, obviously higher than 26.528.3%106cfu/g of the buds treated with organic planting. Fixing Technique didnt influence the endophyte number in the bud of “DABAOHAO” treated with organic planting, while the number decreased 30.10% in the bud treated with normal planting. “DABAOHAO” contained four genus of endophtic bacteria, such as Rhodobacter, Microbacterium, Rhizobium and Variovorax, and the “FUYUNLIUHAO” only had Rhizobium, and Variovorax. 11 endophytic bacteria of theasienensis showed inhibition abilities to 10 pathogenies. Eb 659 (R. radiobacter) had the biggest inhibition spectrum, which could inhibit 3 kinds of pathogenies, Ralstonia solanacearum, Acidovorax avenae subsp. citrulli and Verticillium dahliae.Keywords：Theasienensis, endophyte, isolation, fatty-acid detection, biocontrol随着全球对资源和环境问题的广泛关注，实现可持续发展战略得到世界各国的认同和响应。使用化学杀菌剂是控制农作物病害的有效方法，但化学杀菌剂污染环境，诱导病菌抗性增强，破坏生态平衡，因此植物病害的生物防治研究越来越受到重视1。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注2。人们发现植物体内存在大量有益的内生细菌和内生真菌，这些内生菌在植物体内能产生多种生物学作用，可以提供植物所需要的营养物质如氮源(内生共生固氮)及一些激素，参与植物的防卫功能，能够促进植物快速生长，增强植物抗逆境、抗病害、抗动物危害的能力3。由于内生菌具有在植物体内独立自主的分裂繁殖和传递的特性，使之有可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌，因此分离并利用作物的内生菌控制作物的病虫害、开发有益内生菌以提高作物产量和品质对于可持续性农业具有重要意义4。福建省是茶叶种植和生产大省，全省共有茶园面积14.5hm2，居全国第三位，因此开发茶叶内生菌作为生防制剂有着良好的发展前景。本研究拟从茶叶上分离筛选具有广谱抑菌活性的内生细菌，应用于植物病害的生物防治。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试植物 茶叶样本于2006年3月采自福鼎品品香茶业有限公司和福安市天香茶叶有限公司的有机茶生产基地和加工厂，茶叶品种为大白毫和福云六号，种植方式为有机种植或和普通种植，加工工艺为杀青和未杀青，叶为老叶和芽叶。样本采回实验室后在24 h内用于微生物的分离。1.1.2 供试病原菌 猪大肠杆菌K88（Escherichia coli），购自中国兽药监察所；棉花黄萎病大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），购自德国菌种中心（DMSZ）提供；西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli），由福建农林大学提供；黄曲霉（Aspergillus flavus），由福建师范大学提供；番茄枯萎病尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）由浙江大学提供；番茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），甘蓝轮枝菌（Verticillium longisporum)，西瓜枯萎病尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum），泽泻白斑病菌（Ramularia alismatis），苦瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare），均由本实验室分离。1.1.3 内生菌分离、增殖、拮抗测定培养基 细菌分离与增殖培养均采用NA培养基，真菌培养与拮抗测定均采用PDA培养基，放线菌分离采用高氏一号培养基。1.1.4 脂肪酸提取培养基与试剂 TSBA培养基：30 g胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic soy broth，TSB）+15 g琼脂+1 L水（TSB购于Fisher公司）。皂化试剂：氢氧化钠45 g+甲醇150 mL+水150mL；甲基化试剂：6N盐酸325 mL+甲醇275 mL；萃取试剂：正已烷200 mL+甲基叔丁基乙醚200 mL；洗涤试剂：氢氧化钠10.8 g+水900 mL（配制方法由MIDI公司提供）。1.2 方法1.2.1 茶叶内生菌的分离 采用植物表面消毒法对不同茶树品种的叶子进行表面处理后，并以不同培养基进行内生细菌、真菌和放线菌的分离。根据菌落形态、颜色等随机挑取单菌落，按常规方法纯化后保存，供测试鉴定。1.2.2 茶叶内生细菌的脂肪酸鉴定 脂肪酸的提取 细菌培养条件：TSBA平板培养基，四线划线法，培养温度281 ，培养时间242 h。获菌：用接种环挑取3-5环（约40 mg湿重）的菌落置入一个干净、干燥的有螺旋盖的试管中（最佳的获菌区域为第3区）。皂化：加入1.00.1 mL皂化试剂，拧紧盖子，振荡5-10 sec，放入95-100 的沸水中5 min，室温冷却，振荡5-10 sec，再水浴25 min，室温冷却。甲基化：开盖加入2.00.1 mL甲基化试剂，拧紧盖子，振荡5-10 sec，801水浴10 min，移开且快速用流动自来水冷却至室温。萃取：加入1.250.1 mL的萃取试剂，拧紧盖子，温和混合旋转10 min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部份。基本洗涤：加入3.00.2 mL洗涤试剂，拧紧盖子，温和混合旋转5 min，打开管盖，利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶，用于气相检测。 脂肪酸的气相色谱检测 气相色谱系统采用的是美国Agilent 6890N型，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；分析软件应用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件Sherlock MIS4.5（Microbial Identification System）和 LGS4.5（Library Generation Software）。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170 起始，5 min-1升至260 ，而后40 min-1升温至310 ，维持90 sec；汽化室温度250 、检测器温度300 ；载气为氢气（2 mLmin-1）、尾吹气为氮气（30 mLmin-1）；柱前压l0.00 psi（1psi=6.895 kPa）；进样量l l，进样分流比100:l。 脂肪酸鉴定 系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值确定目标组分的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(similarityindex，SI)，从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种的SI比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。以脂肪酸混合标样校正保留时间。1.2.3 茶叶内生细菌抑菌谱的测定 将1.2.1中分离得到的15株茶叶内生细菌进行抑菌谱测定。供试菌株的培养：将各供试内生菌株在NA平板上活化，用NA培养液于30、170 rmin-1振荡培养48 h备用。拮抗测定试验采用改良的琼脂扩散法。7株病原真菌在PDA平板上培养25 d后，用无菌水冲洗菌苔，配成孢子悬浮液。吸取制备好的孢子悬浮液1 mL，加入到熔化并冷却到45左右的6 mL PDA培养基（琼脂含量为0.9%）中，混匀，倾覆在已凝固的PDA平板上。待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔（直径为6 mm），在每个孔内加内生菌发酵液40 L，每处理设3个重复，以无菌水为对照，将平板置于25 恒温培养箱内培养24 d后观察抑菌情况及抑菌圈大小。3株病原细菌在NA培养液中发酵培养至对数生长期，吸取制备好的发酵液1 mL，加入到熔化并冷却到45 左右的6 mL NA培养基（琼脂含量为0.9%）中，混匀，倾覆在已凝固的NA平板上。待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔（直径为6 mm），在每个孔内加内生菌发酵液40 L，每处理设3个重复，以无菌水为对照，将平板置于25 恒温培养箱内培养12 d后观察抑菌情况及抑菌圈大小。2 结果与分析2.1 茶叶内生菌的分离供试茶叶样本内生菌分离培养的试验结果见表1、2。从7份样品中共分离到16株细菌，1株真菌，没有分离到放线菌。不同品种间、不同种植方式和不同的加工方式的茶叶样本的内生菌种类和含量均存在着一定的差异。茶叶品种“福云六号”和“大白毫”的新鲜采摘的老叶中均未检测到内生菌，而芽叶中均存在着大量的内生菌，分离到的内生细菌数量为26.0139.5106cfu/g。同样是有机种植，“福云六号”芽叶的含菌量是“大白毫”的1.94倍。常规种植的“大白毫”的芽叶的含菌量为97.5139.5106cfu/g，明显高于有机种植的26.528.3%106cfu/g。杀青工艺对有机种植“大白毫”芽叶内生菌含量没有明显影响，但却使常规种植芽叶的内生菌含量降低30.10%。表1 7种茶叶样本内生菌的分离结果Table 1 Endophytes isolated from 7 different theasienensis samples样品Sample品种名Variety采集地点Collection site类型Type内生细菌Endophytic bacterium内生真菌Endophytic fungus内生菌总量Total种类含菌量（106cfu/g）种类含菌量（106cfu/g）种类含菌量（106cfu/g）大白毫福鼎常规种植，杀青期长，芽叶4 97.500.04 97.5大白毫福鼎常规种植，杀青期短，芽叶3139.500.03139.5大白毫福鼎有机种植，杀青过，芽叶3 26.012.34 28.3福云六号福安有机种植，新鲜采摘，芽叶3 51.500.03 51.5福云六号福安有机种植，新鲜采摘，老叶0 0.000.00 0.0大白毫福鼎有机种植，新鲜采摘，芽叶3 26.500.03 26.5大白毫福鼎有机种植，新鲜采摘，老叶0 0.000.00 0.0样品号分离到4株不同菌落形态的细菌，样品II号与、II号、IV号和号各分离到3株不同菌落形态的细菌。同时，III号样品还分离到真菌1株。上述菌株分别编号为Eb646-Eb662。内生细菌在茶叶中的含量差异显著，含量最小的Eb656仅为2.0106cfu/g，含量最高的是Eb651，高达115.0106cfu/g。表2 各个茶叶样本分离到的内生菌的含菌量Table 2 Population of each endophyte isolated from the theasienensis samples样品编号菌株编号内生菌类型含菌量（106cfu/g）Eb646真菌2.3Eb647细菌22.0Eb648细菌52.5Eb649细菌9.0Eb650细菌14.0Eb651细菌115.0Eb652细菌14.5Eb653细菌10.0Eb654细菌21.0Eb655细菌3.0Eb656细菌2.0Eb657细菌32.0Eb658细菌9.0Eb659细菌10.5Eb660细菌7.5Eb661细菌13.0Eb662细菌6.02.2 茶叶内生细菌的脂肪酸鉴定由茶叶样本中分离出来的15株细菌的脂肪酸气相色谱检测与MIDI数据库比对的结果见表3。从表中可见，在TSBA50数据库中，Eb648、Eb650、Eb651、Eb652、Eb653、Eb654、Eb658、Eb660这8株菌株SI在0.500以上，表明为典型菌种，其中Eb648为类球红杆菌（Rhodobacter sphaeroides）；Eb650为放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter），Eb651为Microbacterium testaceum，Eb652、Eb658为争论产碱菌（Variovorax paradoxus）；Eb653为Rhizobium rubi，Eb654为树状微杆菌（Microbacterium arborescens），Eb660为蛾微杆菌（Microbacterium imperiale）。表3 茶叶内生细菌的脂肪酸气相色谱检测与MIDI数据库比对的结果Table 3 Comparison results between the fatty-acid GC detections of theasienensis endophytic bacteria and MIDI library 菌种名称LibrarySimilarity Index*Entry NameEb647MOORE50.199Prevotella-loescheiiEb648TSBA500.729Rhodobacter-sphaeroides (Rhodopseudomonas sphaeroides)Eb649TSBA500.328Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb650TSBA500.799Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb651TSBA500.774Microbacterium-testaceum (Aureobacterium, Curtobacterium)Eb652TSBA500.607Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb653TSBA500.527Rhizobium-rubi (Agrobacterium)Eb654TSBA500.618Microbacterium-arborescens (Flavobacterium)Eb655CLIN500.253Pseudomonas-fluorescens-biotype A & FEb656CLIN500.454Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb657TSBA400.486Cellulomonas-flavigena*Eb658TSBA500.740Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb659TSBA500.421Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)Eb660TSBA500.609Microbacterium-imperiale Eb661TSBA500.338Variovorax-paradoxus-GC subgroup A (Alcaligenes paradoxus)Eb662TSBA500.374Rhizobium-radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)* 细菌鉴定仪对于Similarity Index的诠释：大于0.500：说明匹配性很高，为典型的菌种， 大于0.300小于0.500：说明匹配性较低，为非典型菌种， 小于0.300：说明数据库没有此菌种的数据，给出的是最接近的相关菌种。Eb649、Eb656、Eb657、Eb659、Eb661、Eb662这6株菌株分别在TSBA50、TSBA40、CLIN50数据库里SI介于0.300与0.500之间，匹配性较低，为非典型菌种。结合平板菌落形态，除去Eb657以外的其他5株菌的鉴定结果可确认为正确的。而Eb647、Eb655这2株菌在所有数据库中找到的SI都很低，数据库没有这些菌种的数据，有可能为新种。Eb657、Eb647和Eb655菌株有待于进一步的鉴定。将上述已确认的13株菌株根据样本来源进行分类的结果见表4。“大白毫”（样本I、II、III、VI）带有红杆菌属（Rhodobacter）、微杆菌属（Microbacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）和贪噬菌属（Variovorax）这4个属的内生细菌。“福云六号”（样本IV）仅含有根瘤菌属和贪噬菌属。两种茶叶品种含有的相同的内生细菌为放射根瘤菌（R. radiobacter）和争论贪噬菌（V. paradoxus）。表4 茶叶样本中所含的内生细菌菌株种类Table 4 Varieties of endophytic bateria in different theasienensis samples样本号Rhodobacter-sphaeroidesMicrobacteriumRhizobiumVariovorax-paradoxus-GC subgroup AtestaceumarborescensimperialeradiobacterrubiEb648Eb650Eb649Eb651Eb653Eb652Eb654Eb656Eb659Eb658Eb660Eb662Eb6612.3 茶叶内生细菌抑菌谱的测定试验结果见表5。因有Eb648在在保存中缺失，因此仅有15株茶叶内生菌用于抑菌谱的测定。供试的15株菌中，有11株对供试病原菌表现出拮抗活性。内生菌Eb656、Eb657、Eb658、Eb659都对番茄青枯雷尔氏菌表现出很强的拮抗作用，抑菌圈大小为33.0043.00 mm，其中抑菌效果最好的是656号菌株。Eb656、Eb657、Eb659菌株对号西瓜细菌性果斑病菌具有拮抗作用，抑菌圈大小分别为22.50、28.00和53.00 mm。8株内生菌Eb652、Eb653、Eb654、Eb655、Eb659、Eb660、Eb661、Eb662对棉花黄萎病大丽轮枝菌具有拮抗作用，其中抑菌效果最好的是660号菌株，抑菌圈可达到35.00 mm。此外，Eb660、Eb661、Eb662菌株对西瓜枯萎病尖孢镰刀菌具有拮抗作用；Eb658号菌株对番茄枯萎病尖孢镰刀菌具有拮抗作用。这15株内生菌都没有表现出对猪大肠杆菌K88、黄曲霉、甘蓝轮枝菌、泽泻白斑病菌和苦瓜炭疽菌这5株病原菌的抑制活性。表5 15株茶叶内生菌抑菌谱测定结果Table 5 Inhibition spectra of the 15 endophytic bacteria against 10 pathogenies 内生菌抑菌圈直径（mm）*番茄青枯雷尔氏菌猪大肠杆菌K88西瓜细菌性果斑病菌黄曲霉甘蓝轮枝菌西瓜枯萎病尖孢镰刀菌泽泻白斑病菌棉花黄萎病大丽轮枝菌番茄枯萎病尖孢镰刀菌苦瓜炭疽病菌Eb647-Eb649-Eb650-Eb651-Eb652-18.50-Eb653-15.50-Eb654-13.50-Eb655-13.00-Eb65643.00-22.50-Eb65737.00-28.00-Eb65833.00-12.75-Eb65938.00-53.00-25.00-Eb660-13.75-35.00-Eb661-12.75-20.00-Eb662-13.75-21.50-*“-”代表没有拮抗活性。在15株供试的内生细菌中，Eb659号菌株有着最广的抑菌谱，能够抑制3种病原菌，番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果班病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌株；Eb656、Eb657、Eb658、Eb660、Eb661、Eb662这6株菌株各能抑制2种病原菌；Eb652、Eb653、Eb654、Eb655号这4株菌株各能抑制1株病原菌；而Eb647、Eb649、Eb650、Eb651没有对供试的10株病原菌表现出拮抗活性。3 讨论植物内生菌生活在活体植物组织中，其生长代谢受多方面因素制约，包括宿主植物和外界环境因子等等5。谢丽华等（2006）研究了茶树品种、叶片龄期及叶片化学成份对茶树内生真菌分布影响的研究，发现在供试的毛蟹、铁观音、黄旦和福云六号这4个茶树品种内，黄旦的内生真菌分离频率迭100，而福云六号只有7.5，表明茶树品种不同或遗传背景不同，其叶片中内生真菌的发生存在明显差异；同时随着茶树叶片的成熟，叶片中内生真菌的种类与数量逐渐增多，与叶片龄期呈正相关，叶片龄期影响茶树内生真菌的种群结构。并且还发现，在成熟的茶树叶片组织中，内生细菌的分离频率很低6。本研究在大白毫中样本中分离到一株内生真菌，但在福云六号中未分离到内生真菌。同样地，在福云六号和大白毫的老叶中均未分离到内生细菌，而两种茶叶品种的芽叶中均分离到3-4种的内生细菌。上述结论也表明内生菌在茶叶的种类与分布会因茶叶品种和叶片龄期的而存在着差异。此外，本研究还发现不同的种植方式和杀青工艺也会影响茶叶的内生菌的存在。脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质，是生物体的基本结构成分之一，在细胞中绝大部分脂肪酸以结合形式存在，构成具有重要生理功能的脂类，它是构成生物膜的重要物质；是有机体代谢所需燃料的贮存形式；作为细胞表面物质与细胞识别、种族特异性和细胞免疫等有密切关系。脂肪酸和细菌的遗传变异、毒力、耐药性等有极为密切的关系7,8。细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱9。国内外已有把脂肪酸用于细菌鉴定的报道10-12。目前，在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过120种(隶属于54个属)。这些内生细菌大多为土壤微生物种类，其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Eterobacter)以及土壤杆菌属(Agrobacterium)为最常见的属13。洪永聪等（2005）进行了从茶叶上分离筛选对茶树叶斑病防病效果好、对拟除虫菊酯类农药降解效能高的内生细菌的研究。对福建茶树优良品种铁观音、黄旦、毛蟹、肉桂4种茶叶品种的芽叶、老叶和叶斑病的内生细菌进行分离和筛选，结果表明，茶叶内存在大量的内生细菌，分离到的内生细菌数量为2.939.4l06cfu/g，不同品种间有一定的差异，同一品种间病叶与健叶的内生细菌数量差异显著。所有的分离菌株中有l4株对四种茶树叶斑病菌都有不同程度的拮抗效果，且在氯氰菊酯平板上生长良好，但是仅鉴定了其中效果最好的一株菌TL2，为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）14。本研究从福云六号和大白毫的芽叶中分离到的内生细菌数量为26.0139.5106cfu/g，分离到的内生细菌经脂肪酸鉴定从属于带有红杆菌属（Rhodobacter）、微杆菌属（Microbacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）和贪噬菌属（Variovorax）这4个属的内生菌。关于植物内生菌在防治病害、促进植物生长发育以及固氮方面的作用，国内外都有研究，我国有从棉花、水稻、马铃薯、番茄、辣椒等植物中分离到内生菌，并证明了某些内生菌对植物病害具有防治效果的报道15。吴蔼民（2000）报道了内生菌73a和Ala对棉花黄萎病的田间防效及增产作用，其中73a的田间防效达51.28，表现出18.15的增产效果16。袁军等(2002)报道了防治马铃薯环腐病有益内生菌的分离和筛选及防病效果，筛选出5个比较好的菌株，其中118菌株定殖、促生、拮抗3种作用兼备17。黎起秦等(2003)报道了番茄青枯病内生拮抗细菌的筛选及防病效果。其中内生菌B47对番茄青枯病的大田防效达74.9818。何红等（2004）报道了辣椒内生拮抗细菌的筛选及防病效果。其中BS-1和BS-2菌株对辣椒炭疽菌的防效10d以后为57.3494.0819。张立新等（2005）报道了番茄内生真菌对多种植物病原菌的抑制效果。其中Fq72菌株的培养滤液对灰霉和菌核病菌的抑制效果分别达到75.68和66.1120。本研究供试的15株菌中，有11株对供试10种病原菌表现出拮抗活性。放射根瘤菌Eb659号菌株有着最广的抑菌谱，能够抑制3种病原菌，番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果班病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌株，尤其是对西瓜果斑菌具有极好的抑菌效果，抑菌圈能达到53.00 mm，对于作为生防菌防治植物病害具有一定的应用和开发价值。其在植株体内的定殖效果以及田间防效有待于进一步的试验。参考文献：1 俞晓平，陈列忠，申屠旭，等植物内生菌及其代谢物在生物农药创制中的应用J浙江农业学报，2006，18(5)：289-2932 何劲，刘蕴哲，康冀川植物内生菌及其在农业和医学上的用途J贵州农业科学，2006，34(3)：113-1153 姜怡，杨颖，陈华红，等植物内生菌资源J微生物学通报，2005，32(6)：146-1474 付洁，侯军，谢芳芹，等植物内生菌农药活性研究进展J陕西农业科学，2006(3)：66-685 李能章，彭远义植物内生菌研究进展J生物技术，2004，14(2)：69-716 谢丽华，徐焰平，王国红，等.茶树品种、叶片生育期和茶叶化学成份对内生真菌的影响J菌物研究，2006，4(3)：35-417 张国赏，吴文娟，潘仁瑞气相色谱-质谱法检测细胞脂肪酸及其在细菌鉴定上的应用合肥联合大学学报，2000，10(4)：92-968 Merry S. Riley, Vaug