如何正确的进行ELISA测定操作.doc

如何正确的进行ELISA测定操作点击次数： 321 作者：佚名 发表于：2008-08-04 13:35转载请注明来自丁香园 来源：丁香园临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。 一、临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨46点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： （1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 （3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70以下。（4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 二、试剂准备在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。 三、加血清样本及反应试剂在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 四、温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37和室温，其次是43和28。 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37 30分钟1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37 12小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： 要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。 ELISA法测定单克隆抗体的效价点击次数： 363 作者：佚名 发表于：2008-08-06 16:36转载请注明来自丁香园 来源：丁香园一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA法中。酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNoA0423)；酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNoP0260)；均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。4、洗涤液(含0.05Tween20的PBS)：1LPBS中加入Tween-20500L.5、封闭液(含1牛血清白蛋白，0.1Tween20的PBS)：10mLPBS中加入100mgBSA，10LTween-20.6、底物溶液磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/LpH6.0)：称Na2HPO412H2O2.2g，NaH2PO42H2O6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL.TMB贮液：称60mgTMB溶于10mL二甲基亚砜中，4避光保存。底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TNB贮液10L.30H2O215L，混匀。7、终止液：2mol/LH2SO4四、操作步骤抗原包被：兔抗人IgG作为抗原，用包被液l：8000稀释，100L/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4放置过夜。洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。封闭：加l00L/孔封闭液，室温放置0.5h.洗涤：用洗涤液洗3次。加待测样品(一抗)：将含单克降抗体的细胞培养上清在另-块板上用PBS连续稀释(按照1：2或1：10)，100L/孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37恒温箱温育12h.洗涤：用洗涤液洗3次。加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l：8000稀释，100L孔，加盖37恒温箱温育1h。洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。显色：加新鲜配制的底物溶液100L/孔，室温暗处放置530min，显示蓝色。终止反应、比色：加50L/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。ELISA的概念、原理及操作步骤点击次数： 569 作者：佚名 发表于：2008-08-11 15:36转载请注明来自丁香园 来源：丁香园ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 一、原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。二、操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1、包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml.在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2、加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml.37 孵育0.51小时，洗涤。4、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37 1030分钟。5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml.6、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至110gml，每孔加0、1ml，4过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时，洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6.三、试剂器材1、试剂(1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaHCO 1.59克NaHCO 2.93克加蒸馏水至1000ml(2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15MKH2PO4 0.2克Na2HPO12H2O 2.9克NaCl 8.0克KCl 0、2克Tween-200.050.5ml加蒸馏水至1000ml(3)稀释液：牛血清白蛋白(BSA) 0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成510使用。(4)终止液(2MHSO）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98)21.7ml.(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M NaHPO(28.4克L) 25.7ml0.1M 柠檬酸(19.2克L) 24.3ml加蒸馏水50ml。(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75HO 32l(7)ABTS使用液:ABTS 0.5mg底物缓冲液(PH5.5) 1ml3HO 2l(8)抗原、抗体和酶标记抗体。(9)正常人血清和阳性对照血清。2、器材:(1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50l及100l加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。(2)小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。(3)4冰箱，37孵育箱。四、注意事项1、正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2、在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:(