生物制药专业实验课件（吉林大学）实验具体操作_四

实验内容,打开分光光度计，预热 上午开水浴55度*2个；100度*2个；35度*4个 下午将2个100度水浴调节为45度 8:00 酶活、蛋白 13:00 正交 13:00凝胶层析（老师完成） 电泳录像是否拷贝？,今日实验注意事项：,稀释酶液的时候，按照我们的推荐倍数，从高浓度开始，如要稀释5，10，20倍，先稀释成5倍，再将部分稀释成5倍的酶液稀释到10倍。 E1,E2只有2ml，要进行蛋白含量测定+酶活测定+100 l以后电泳使用；E3虽多，除了以上实验，还有正交试验以及米氏常数的测定。 总之，一次别用完。用来测酶活的稀释后的酶液和原液别急着扔掉，测蛋白含量的时候也许可以在此基础上稀释或使用;另外没有稀释的2个EP管中的E1，E2和离心管内的E3放冰箱里。 稀释合适倍数的标准是最后OD在0.1-0.7以内,测酶活稀释方法举例（稀释5、10、20倍）：,E1、E2、E3酶活力及蛋白质浓度的测定,酶活力的测定： 样品前处理：测定E1、E2、E3酶活时，用pH4.6, 0.2mol/L的醋酸缓冲液进行稀释。（E1稀释10倍、20倍,40倍，80倍；E2稀释50倍、100倍，200倍; E3不稀释或5倍，10倍） 空白管中加入E2稀释为最大倍数的酶液2ml，再加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活 其他试管做测定管，分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液2ml 所有上述加有酶液的试管（包括空白管）和5%的蔗糖溶液（存放于烧杯中或量筒中）放入35水浴中预热恒温（10min）； 分别取2ml 5%的蔗糖加入上述试管中，开始计时，准确反应3分钟，于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。,从上述试管中各取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀（注意摇匀方法），于沸水浴中准确反应5min，立即用流水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。 酶活力计算：根据葡萄糖标准曲线公式计算出所测定光密度值对应的葡萄糖含量毫克数，按下面公式计算酶活力： 蔗糖酶活力（单位数/1毫升）=葡萄糖毫克数9酶的稀释倍数/2/2 蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。 注意： 540nm,蛋白含量的测定：,蛋白含量推荐稀释倍数：E1（大约稀释50、100、200、400倍），E2（稀释5、10或20倍），E3（不稀释或稀释5倍、10倍）。用去离子水稀释即可。 蛋白含量测定：取若干试管各加入1ml已经稀成一定浓度的样品液，其他操作（反应和比色测定）同Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线中第7号试管的操作。空白管加1ml去离子水就可以。 注意：A650 蛋白质浓度的计算：根据Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线公式计算出所测定光密度值对应的蛋白质含量g数，按下面公式计算蛋白含量： A650值对应的g数(Pr)10-3 Pr (mg/ml)= 稀释倍数 Pr溶液的ml数 （1ml）,实验操作 1、教师汇总收集到E3的峰尖浓缩后进行凝胶层析实验 2、凝胶层析制E4 （1）装柱：将玻璃柱固定垂直，装入脱气的蒸馏水（约为柱体积的 1/3），以避免胶粒直接冲击柱底支持物； （2）固定玻璃柱，调整垂直； （3）装凝胶：边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入凝胶(打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉降，以免胶面倾斜和发生断层； （4）检查：用眼观察有无凝胶分层、沟流和气泡现象； （5）柱平衡：用脱气水平衡凝胶柱，用出口处的螺旋夹将流速控制在 1ml/min（用量筒和秒表测定）；（提前装好G100）,凝胶层析实验（老师完成）,实验操作,（6）上样：将柱中的5mmol/L pH6.0缓冲液逐渐放出，当液面接近柱床表面时，用长吸管沿柱壁绕环小心加入E3，上样量控制在柱体积的2%-5% （千万不要冲坏柱床表面）；打开凝胶柱出口处的阀门，使样品缓慢、均匀地进入柱床，然后用少量缓冲液清洗柱的内壁，并将清洗液也流入凝胶柱，关闭凝胶柱出口处的阀门。 （7）洗脱：在凝胶上面缓慢加入缓冲液，连接恒压洗脱瓶，开始洗脱 （8）收集：根据记录仪上的蛋白峰手工收集（或者用部分收集器收集），收集峰尖处的酶样品，用PEG6000浓缩后，用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。 有时间刷洗试管和血糖管及配制响应面的缓冲液（稀释不同浓度和pH的缓冲液）,1）将已配制好的三种不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液于9支试管中按表1要求，进一步稀释至一定浓度。(每种pH值的缓冲液配置3种浓度,共9管) 表1 三种不同离子强度的稀释表,正交实验,表2 因素水平表(有改变),2) 将离子交换得到的E3用去离子水稀释蔗糖酶液， (稀释倍数为上次酶活测定时E3的稀释倍数，OD在0.1-0.7之间)。 3）另取9支试管，编号1-9，按表3中2、3列的要求， 分别加入上述不同pH不同浓度的缓冲液2ml及蔗糖 酶液1ml，混匀。 4）按表3中第一列的要求，将1-9号试管分别放入相应 温度的恒温水浴中保温10min。 5）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分别置于35、 45、55水浴中保温5min（试管中保温）。 6）向1-9号试管中，依次间隔1min（或2min）加入相 同温度下保温过的0.2mol/L蔗糖液1ml，立即记时， 摇匀，放回原来温度的水浴中，准确反应3min。,7）按上述次序和时间间隔，加入1mol/L NaOH液0.5ml， 摇匀。 8）空白管：另取一支“0”号试管，加入酶液1ml，1mol/L NaOH液0.5ml，摇匀，再加入蔗糖液（0.2mol/L）1ml及pH4.6 0.1M缓冲液2ml。 9）分别于各管中吸取反应混合物0.5ml，加入去离子 水1.5ml和3ml DNS试剂于血糖管中，放入沸水浴中 准确反应5min，急速水冷后，稀释至25ml，摇匀。 以空白管为参比，测出A540值。 注意：正交试验共10管（1空白+9管）,A：温度 B：pH C：浓度,表3 试验方案、结果及数据处理表,四.数据处理 1）数据记录：将上述试验的结果（9个数据），填入表 4中的Yi项内。 2）数据整理及分析 A.按表4要求，计算出各水平下试验结果总和，即第1、 2、3列上的K1、K2、K3并求出k1、k2、k3和k的R值（极 差）。 B.选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的 顺序，比较k值选出优水平组合（即好的试验条件）。,试验结果的计算方法 A因素列 B因素列 C因素列 K1 y1+ y2+ y3 y1+ y+ y y1+ y+ y K2 y+ y+ y y+ y+ y y+ y+ y K3 y+ y+ y y+ y+ y y+ y+ y k1 K1 3 K1 K1 k2 K K K k3 K K K R kmax.-kmin. km