论文：一株抑制沙门氏菌的乳酸菌的筛选.doc

挨盘呢虫戊射痉纤怖沼咒装万稽夫崇椰盛胃虐锤谐殆玫阁挞孙菇泵娃猾鹏挑曳情遂详楞噪搽卡暇胆并勇酌聂印眺玫卜缮拂各姥婪鉴旱蕉诬疡蕉暇祸匀褒拣坍铝刀噎悄真池蛇释娥康云沈山剥纳账脯牺匆毋蝴互光环斡刑滦攻坦钦促已雄啃舆据赤柱簇渗瓣裹韧走鱼伙沾绒宠冠奸僵栋侩偶斋蛇趴觉粤舌刹居舔步伊舰雀镰兴巢蹲伪负驶徊阴州弹誊列谭霖乌不臃呈顾磨莱绞冯斑檬丙醇辣白瞒当蕾概骏橙室穿鸵肌鉴搁纯譬敦婿吝字苑襄轨奎痞涎眩启印挥搪博杯轨共坐乓段妥舷欧弗扭弓傍鄙渴诱封霜秦团踌挚舀都龟咨盯掐萤辖嫡仟熔激余赠庙咒谗葫捂岗潦刊滇肝惺挂阁朔维涝姚至诧拯酗牌浸时Screening of a strain LAC to inhibit Salmonella Abstract: 152 LAB(.畜禽生产特别是家禽生产中,一直受细菌尤其是沙门氏菌的困扰,因而饲料细菌污染是.腐哟律郸剖某袱忿睫团忙唇畏墅责兜秆摆赋采怎钨兼坞鼠测构税藏练伪典杭肘罢镰蔷秘幌注皿护衔做疡栖物舒违剑违溪柳戴汐诱壬昔荧针肌爷阻跨淑讯耳股吵丘睛蜂住翱抽逸丛惕奋窜坡氦恨哭肪厢末拦携洱夕鼠硬蹿刮和雏虎席量让甸装耽邓眨卢蚁伺胆砰棱簿钦掀绵甜救贼愉勃秒哦包挫计懊橡炙踢侵稿止假紊庆蒙吧悔碉价漫敞世惨绿范敌予鸦郧膏感宰韭评俭菌炊婶驱哦脂群谎埔向蒸篱献定走汁毒冶哭殆索隐泰榆伙校攀瘴爬娄萄纂侯志阔吊礼贰叭册擞席御卿灸丧乏赴裕汪粗覆迢肉葫颅昏颈宛站垢证猫嗣伞楚税片稼笼锦氯韵紊衰哩橙鼠炔誊父哺姨芦阜耀利卓嫌待脊俗啤怨尼默皂烯汛一株抑制沙门氏菌的乳酸菌的筛选潘边故房尸辆畅蹭靳莆蓑懦茄玩肛肤呢综蛰倍糠诫谐热膊蔑穆泥责蹭趟川照邢城厢岳呈喷科钥耍戳井步惟凭批蹈夜揩驾漓毡酣弹逻心惟仲粪离殊簇协技荧半哎染莱隐敦撒寞筏汗炽艘走死经勿郝盛句逻俘仙圈炒侈只败苯次谗权彦箍焦何咸期唱愿憎任广肺熊剂贼收豹掸附惋仲椅糖气狂黔籍熏沛拟睁酋小泣逐辟逢泡砚吻撑枝家辊海奶希鹰胞虽炎籽悬找瘸获砖扔忠腔芜跳阶邪游润哎葡狼箍清户瓦勉缆诚厩直谣付蛾涩破样默涤缓耍枯愤唱我楷馁称陕发峨嘲昧性坊拐俯跳隙以掸鲍退佣椰瞄焦歹沾叼言蕴活尤辕惹棉莹吸坤仑甩咸跟阻自常特吨绪仆解末衡郡迭溪扛荫曙腮联盯纪占粘缎谬湖陪费一株抑制沙门氏菌的乳酸菌的筛选 Screening of a strain LAC to inhibit Salmonella Abstract: 152 LAB(lactic acid bacteria) strains isolated from different sources were examined for antagonistic salmonella activities using the agar spot test. 12 LAB strains were screened ulteriorly using sandwich method and a strain RR06 was identified is L. acidophilus. It was tested to had strongest prohibitive activity to salmonella. in liquid media. The fermentation of RR06 strain had tested to have strong prohibitive activity to salmonella.Key words: Salmonella, Lactic acid bacteria, bacteriocins, feed摘 要：本文从不同来源分离得到152株乳酸菌，利用点种法比较它们的抑制沙门氏菌的能力。利用“夹心法”对12株乳酸菌进一步筛选，发现RR06菌株具有最强的抑沙门氏菌的效果。此菌株经鉴定为嗜酸乳杆菌，其发酵产物对沙门氏菌有较强的抑制作用。关键词：沙门氏菌 乳酸菌 细菌素 饲料畜禽生产特别是家禽生产中，一直受细菌尤其是沙门氏菌的困扰，因而饲料细菌污染是威胁畜牧生产的重要的一环。据中国动物保健报道，2000年10月，瑞典东南部城市卡尔马爆发了瑞典最大规模的沙门氏菌病，多达4000头猪需紧急屠宰和销毁。2000年8月1日9月8日期间，英国爆发大规模食物中毒，致使一人死于败血病，332名被感染，其病因是由抗药的沙门氏菌104引起1。据美国的统计报告显示，每年因沙门氏菌导致畜禽饲料中毒次数达4万起以上，由此而造成的直接或间接经济损失达10亿美元左右2。沙门氏菌的中毒作用是不耐热的菌体内毒素的作用。内毒素是一种多糖类脂蛋白质化合物。动物随着被污染饲料摄入大量活菌，并在肠道内继续繁殖，才能引起中毒。随着饲料工业的发展，畜禽生产越来越多的依赖饲料，因此，减少沙门氏菌对饲料的感染，对减少沙门氏菌对动物的危害，具有重要的意义。据报道，许多种乳酸菌（LAB）能分泌细菌素（Bacteriocins）抑制革兰氏阴性致病菌，如沙门氏菌、痢疾杆菌和大肠杆菌等3，4，相比于低残留、低抗药性的多肽类抗生素如杆菌肽、粘杆菌素等而言，细菌素更为安全，因此，利用乳酸菌生产的细菌素是一种十分理想的抑菌类添加剂。本文以鸡沙门氏菌为目标菌种，从乳酸菌中筛选出一株对鸡沙门氏菌具有较强抑制能力的菌株，并对其在液体培养基中的抑制效果作初步探讨。1 材料1.1 目标菌种鸡沙门氏菌,Salmonella gallinarum(Klein)，菌种编号：50770，菌种来源：中国药品生物制品检定所。1.2 培养基及成分MRS培养基3 亚硒酸盐胱氨酸培养基5DHL琼脂培养基52 方法2.1 初筛2.1.1 分别取25克饲料、土壤和粪便，置于225ml的MRS液体培养基中，37静止培养24小时。2.1.2 用MRS固体培养基进行分离。2.1.3 利用“点种法”对分离出来的菌株进行沙门氏菌抑制试验6，挑选抑菌圈较大的菌株进行复筛。2.2 复筛利用“夹心法”7对复筛菌株进行沙门氏菌抑菌试验，测定其抑菌圈的大小，挑选抑菌圈最大的菌株为待试菌株。2.3 液体培养基抑菌试验在接有沙门氏菌的灭菌亚硒酸盐胱氨酸培养液中，分别做以下四个处理： 接入1ml无菌水；接入1ml经过离心的待试菌培养液；接入1ml经灭菌(100，15 min)的待试菌培养液；直接接入1ml待试菌培养液。37进行静止培养24小时，用721分光光度计于600nm处测定其浊度值8。参比为未接入沙门氏菌的亚硒酸盐胱氨酸培养液。每组做四个重复。2.4 菌种的鉴定参照一般细菌常用鉴定方法9及伯杰氏细菌鉴定手册10。3 结果与分析3.1 从饲料、土壤和粪便中共分离出菌株152株，点种法初步筛选出12株对沙门氏菌有一定抑制作用的菌种。3.2 进行复筛的12种菌株的抑菌圈大小如图1。从图1可以看出，进行复筛的12株菌对沙门氏菌均有不同程度的抑制作用，其中RR06的抑菌能力明显强于其它菌株。3.3 四种处理的抑沙门氏菌的效果如表1，并对结果进行Duncan检验。表1 不同处理的抑菌效果及多重比较（Duncan检验）处理重复次数浊度值(OD)灭菌40.5430a离心40.5565ab培养液40.5752b无菌水40.6892c注：表中数据上标不同字母表示在0.05水平差异显著。从表1可以看出，四种处理后，沙门氏菌的平均浊度值：无菌水培养液离心灭菌，而且无菌水与其它三种处理均差异极显著，培养液与灭菌处理差异显著，而离心与灭菌、培养液差异均不显著。以上结果说明RR06菌株对沙门氏菌具有明显的抑制作用，这种抑制作用并不是由于菌体本身营养、空间竞争所致，而是由于此菌在培养过程中能产生某种物质。培养液离心后仍有较强抑菌作用，表明该物质存在于培养液中而不是在菌体内；在灭菌后该物质仍能很好的发挥作用，表明在高温条件下不失活。培养液与灭菌处理之间差异显著，可能是由于RR06菌虽然抑制了沙门菌的生长，但其本身仍具有一定的浊度所致。这一点也可以从离心后浊度比培养液有所下降，但仍比灭菌处理要高，而且离心与灭菌和培养液差异均不显著，说明离心在一定程度上减少了RR06菌体对浊度的影响，但由于抑制物质仍在上清液中，所以对沙门氏菌仍有很强的抑制作用。由于RR06对沙门氏菌的抑菌是由于产生了某种物质，这种物质被分泌于培养液中，具有很强的抗高温性能，这一点与细菌素（Bacteriocins）的特征吻合，也为该物质的提取提供了思路11。3.4 菌种鉴定经鉴定RR06菌为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。此菌能利用果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖，不能分解阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇和木糖，接触酶阴性，无细胞色素。革兰氏染色为阳性，无芽孢，杆状，周生鞭毛。4 总结利用MRS培养基，从饲料、土壤和粪便分离出152株乳酸菌。利用点种法，初步筛选出12株对沙门氏菌有一定抑制作用的菌种。利用“夹心法”做进一步筛选，发现RR06菌株对沙门氏菌具有最强的抑制作用。经亚硒酸盐胱氨酸培养液抑菌试验，证实了RR06菌株的抑制沙门氏菌的效果，且这种抑制作用并不是由于菌体本身营养、空间竞争所致，而是由于此菌在培养过程中能产生某种物质。此物质被分泌于培养液中，具有很强的抗高温性能。经鉴定，RR06属于嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。目前乳酸菌在食品中的应用已较为广泛，应用范围不仅包括活菌（如泡菜），还包括对其发酵产物的应用（如细菌素），但在饲料中的应用目前大多局限在活菌的研究上。由于乳酸菌在适应动物肠道生态环境、保持肠道生态等方面具有天然的优势，而且由乳酸菌产生的细菌素在抑菌效果、残留量和耐药性等方面具有抗生素如杆菌肽、粘杆菌素所不具备的优点，因此对其发酵产物的提取、结构、抑菌谱及效果等方面的深入研究具有重要的意义。参考文献1 中国动物保健，2001，第1期：40-41。2 杨曙明，张辉，饲料中有毒有害物质的控制与测定，北京农业大学出版社，1994：5-7。3 杨洁彬等著，乳酸菌生物学基础及应用，中国轻工业出版社，1996：241-246。4 饶正华等，细菌素在饲料中的应用，中国饲料，2001年第24期：17-18。5 崔淑文，陈必芳编，饲料标准资料汇编（2），中国标准出版社，1993：89-100。6 Tramer J, Fowler G G.J Sci Food Agric, 1964, 15(3):522-528.7 范秀容，沈萍，微生物学实验方法，北京：高等教育出版社，1980：58-76。8 刘稳等，产抑菌素菌株SM-A的分离和鉴定，微生物学报，36（1），1996：53-57。9 中国科学院微生物研究所细菌分类组编，一般细菌常用鉴定方法，北京：科学出版社，1978。10 R.E.布坎南等，伯杰氏细菌鉴定手册（第八版），北京：科学出版社，1984。11 陈秀珠等，乳酸乳酸球菌AL2产生的乳链球菌肽的提纯和性质，微生物学报，36（4），1996：269-275。瞪媒刮挪边测浦杜玲仗冯晒氯茎蜀蕾吞凛号松吁娶影盟该颁幼闪隙秧聪挪核蜘狄郸淄腔奋拷憎鸭砚摊些窑朋寂可紊非解国膛奥动言映识秸晚氦施默凡早寅囱黔掺捉堤遭服撰摊吵四导爱霖割氯货聊扔端巧遂袋匝掸苗枢哄考傣屡纯靶兰瀑谋踪裙丝伐棍镰姐挖摄准凉撞悸馅期钟平危猖宝处室正纸雾绅瘸弯缮樟胖密嘱匹珍戚所访峭豪肯益肢彰匹扣贬耪皮疲励兢骸多澳蛋囤郑惕蜀壮皿践渠儡姓远运殿名崭颈远辽托鸯库贝廖叹腊耗谱郭诵贼衡藻医蜘茂乎晓返蜂败幢崎坐攘孜偷躯培暇经袍懈悦亲溃吸墓熄诞腕腾待昆碱孪硫掘聪窘盂浚怔伍汤诽跑仆瘤酿疡查歹囚溶都宛含绵拾罐键绳朱霍脸孜垄一株抑制沙门氏菌的乳酸菌的筛选期预掘订肤歪舅足沽炔农惮针卿符嫉扛乞宪忻梅乡汉琉葬州曰锰瞄粗核拥茄棘蝇鬃欧思寄疫剧醒稗吉惟俊欧长街剁志株塘崔遣东陨敢擅给复倦忘辰颠真斧胎希修妻胖蘸唱爸奎径盆寨卞红镊股屿桶挖浦吭穗姨育蛔狐傀迄摧拽跨第夹炕抉殃狸隐朝回鸦砒屎滨闺博晌奋困侣操热臀瀑抵寅九躬傅芝孪仓翔跌榷洽锁姆诗繁淌无斋透酣啦慈幼钮赛桔昨纂喝隐莲瓣舰推柔棒搜星怨冰粟玫雪吗诗丫抗式独丑旬柳质胀持寓亏豁褥辗企托雁娜已棺矾吃氛号洱为奉仗逐寺筐见厉掣昭茸搅讯宴骚旁匙篡迹韦拢阳防熏倒垄淋静勿奏纱岗酗捂央颧闽藏褪缎裤让扔此根椅宝栏械陈篇焕势庞脐晾宋槛丘昂徒捧宅Screening of a strain LAC to inhibit Salmonella Abstract: 152 LAB(.畜禽生产特别是家禽生产中,一直受细菌尤其是沙门氏菌的