大鼠全脑缺血再灌注时P38信号转导通路及DNA修复酶KU.doc

啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊临床上常常遇到低血压,休克,心跳骤停等病人,经过积极的抢治后,尽管呼吸心跳恢复,但常遗留不同程度的脑机能障碍.这些都不同程度涉及到脑缺血再灌注损伤.目前的研究.啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊大鼠全脑缺血再灌注时P38信号转导通路及DNA修复酶KU70啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊大鼠全脑缺血再灌注时P38信号转导通路及DNA修复酶KU70的表达及相互关系的实验研究西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科 西安 710004姚凤珍 薛荣亮 王宁 何家璇摘要目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注时不同时点海马CA1区信号转导通路磷酸化激酶P38以及DNA修复酶Ku70的表达变化及相互关系。方法 健康清洁雄性SD 大鼠108只随机平均分为假手术组、缺血再灌注组和干预组。采用四血管阻塞法建立大鼠全脑缺血再灌注模型，干预组于再灌注前30min侧脑室注射P38抑制剂SB203580。分别于再灌注2h、6h、12h、24h、48h和72h处死大鼠，提取海马组织。HE染色观察神经元细胞形态；免疫组织化学方法检测磷酸化P38及Ku70表达；TUNEL检测凋亡细胞。结果 假手术组神经元细胞形态完整，缺血再灌注组神经元细胞形态不完整。假手术组凋亡指数小于缺血再灌注组（p0.05），干预组在上两组之间（p0.05）。假手术组磷酸化P38表达（平均灰度199.22.6）低于缺血再灌注组（156.49.9）（p0.05），干预组（165.38.6）介于两组之间（p0.05）。基金项目：国家自然科学基金资助项目（30571790）通讯作者：薛荣亮，TelE-mail：xuerl假手术组Ku70表达（163.12.1）高于缺血再灌注组（188.84.6）（p0.05），干预组（178.16.6）介于两组之间（p0.05） 。结论 大鼠全脑缺血再灌注早期,海马CA1区P38信号转导通路的激活，DNA修复酶Ku70含量的降低,在促进缺血再灌注区域细胞损伤中可能起重要作用，并且P38信号转导通路激活后可能通过下调DNA修复酶KU70以及其他途径而参与缺血再灌注损伤。关键词：P38；KU70；脑缺血再灌注损伤 The Experimental Research and Relationship between P38 Singal Transferring Pathway and KU70 after Whole Cerebral Ischemia Reperfusion in RatsYao Fengzhen. Xue Rongliang ,Wang Ning,et al(The Second Affiliated Hospital of the Medical College of Xian Jiaotong University ,Shaanxi Xian 710004)Abstract: Objective: To investigate the expression of PP38 and KU70 at different timepoints after whole cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods: 108 healthy clean SD rats were classified into PO ,cerebral ischemia reperfusion (CIR) and SB groups at random.Establish the CIR model according to the 4-VO method.P38 inhibitor SB203580 was injected into the hippocampus 30min before CIR in the SB group.Obtain the hippocampus 2h、6h、12h、24h、48h and 72h after CIR respectively . HE、IHC and TUNEL were applied to observe the neuron morphage,investigate PP38 and KU70 expression,calculate the apoptosis respectively.Results: Neuron cell was complete in the OP group and uncomplete in the CIR group.Apoptosis was observed servere in the CIR group while light in the OP grouup（p0.05） Among the three groups ,the OP group had a low level of PP38（average grey 199.22.6） at all the six timepoints,while the CIR group（156.49.9） had a high level（p0.05） ,with the SB group（165.38.6） between the above two（p0.05）.As KU70 ,the OP group（163.12.1） was high and the CIR group （188.84.6）was low（p0.05）. Conclusion: The activation of singal transferring pathway and deterioration of DNA repairing enzymes may advance ischemia reperfusion injury. The KU70 increased after the P38 inhibitor was administered,therefore,it is possible that the P38MAPK mediate the DNA repairing activities and thus lead to ischemia reperfusion injury. Moreover ,there are other ways through which the p38 pathway participate in the ischemia reperfusion injury.Keywords: P38,KU70,Ischemia Reperfusion临床上常常遇到低血压、休克、心跳骤停等病人，经过积极的抢治后，尽管呼吸心跳恢复，但常遗留不同程度的脑机能障碍。这些都不同程度涉及到脑缺血再灌注损伤。目前的研究认为能量耗竭、氨基酸毒性、梗死周围去极化、氧自由基损伤、钙超载、信号转导通路的激活或抑制、 DNA损伤与修复等参与了脑缺血再灌注损伤1，但是针对上述机制所采取的脑保护措施，在临床上收益甚微。因此，有必要对脑缺血再灌注损伤的机制进行更深入的研究。本实验拟研究P38信号转导通路与DNA修复酶KU70在大鼠脑缺血再灌注时的表达变化及相互关系，进一步揭示脑缺血再灌注损伤的机制，以期为临床防治脑缺血再灌注损伤提供更有力的理论依据。材料与方法 1 1 动物分组 健康清洁雄性SD大鼠108只，鼠龄5565日，体重30020g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。随机分为假手术组（PO,n=36），缺血再灌注组（IR,n=36）及SB203580干预组（SB，n=36）。每组再随机分为缺血再灌注2h,6h,12h,24h,48h,72h6个时点，每个时点6只SD大鼠。 12 模型制作 1.2.1 IR组：采用四血管阻塞法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。以1%戊巴比妥钠40mg/Kg给大鼠腹腔注射施行麻醉（所有动物麻醉均与此相同）。显微镜引导下在大鼠颈部背侧切开皮肤，分离皮下及肌肉，暴露枕后三角，于三角外侧与第一颈椎横突处，看到椎动脉搏动后用25mV电压的电凝器凝断双侧椎动脉，缝合皮下及皮肤。24小时后，以同样的方法施行麻醉，行颈前切口，分离两侧颈总动脉，以无创微动脉夹同时夹闭两侧颈总动脉5分钟，造成全脑缺血（指标为大鼠瞳孔散大，否则剔除），松开动脉夹行再灌注，缝合皮肤切口。1.2.2 SB组：麻醉后，待翻正反射消失，俯卧位固定于脑立体定位仪上。剪去头顶部毛发,碘酊消毒后切开皮肤,参照包新民等主编的大鼠脑立体定位图谱选择右侧侧脑室为注射靶区,于前囟向后0.8mm,中线旁开1.5mm处,用牙科钻钻开颅骨,挑破硬脑膜，再用微量注射器垂直进针3.8mm,注射P38抑制剂SB203580溶液5L ( SB203580用1%DMSO配置成浓度为0.1nmol/L的溶液) 2 3， 以1L/min的速度缓慢注入，注毕留针min,并缓慢退针，缝合创口。在注射结束后min ,予全脑缺血再灌注，方法同IR组。1.2.3 PO组：除了不夹闭双侧颈总动脉和不预先处理椎动脉外，一切同IR组。1.2.4 PO组和IR组按照与SB组相同的侧脑室注射方法，于侧脑室注射相同体积的溶剂（即不含溶质SB203580）。 1. 3 标本采集和组织切片制备：在恢复血液灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h,麻醉大鼠，迅速剖开胸腔，暴露心脏，用号针头从心尖插至主动脉，针头固定防止血液返流，剪开右心房后，用4%多聚甲醛溶液500ml灌注，前200ml快速灌入，后300ml维持6h以保证灌注效果。灌注结束后，断头取脑，分别从视交叉前缘及垂体后缘垂直切割大鼠脑获取海马组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。常规石蜡包埋，连续切片，片厚6微米。1.4 HE染色光镜下观察大鼠海马CA1区神经元细胞形态学的改变。1.5 原位末端标记法(TUNEL)染色检测凋亡指数（凋亡阳性细胞数/整个视野细胞100%）1.6 免疫组织化学染色，利用灰度仪测量磷酸化P38及KU70灰度，分析其表达强弱。1.7 统计学方法：数据以均数标准差(s)表示，经SPSS13.0软件包处理，PO组、IR组、SB组之间所有数据均经单因素方差分析，统计结果P0.05表示有统计学意义。结果 2.1 HE染色结果PO组高倍镜下CA1区神经元细胞结构清晰可见，细胞核为兰色，核膜完整，核仁明显。IR组于缺血后细胞间质水肿明显，排列紊乱，核膜界线不清楚，结构模糊。SB组核膜完整度，核仁清晰度介于上述两组之间。2.2 TUNNEL染色PO组CA1区仅可见少量凋亡细胞。IR组在缺血再灌注后凋亡细胞开始增加，增至高峰，持续至后开始减少。SB组各时点凋亡细胞指数介于上两组之间。见表2.3免疫组织化学染色抗原表达2.3.1 PO组在各时点海马CA1区磷酸化P38均显著低于另两组（P0.01）。IR组各时点磷酸化P38均高于另两组（P0.05），于再灌注后2h开始升高，24h达到峰值后开始下降，至72h降至最低。SB组各时点磷酸化P38表达介于上两组之间，表达趋势与IR组一致。见表 2.3.2 PO组在各时点海马CA1区KU70表达均显著高于其他两组（P0.01）； IR组各时点KU70均显著低于其他两组（P0.01），于再灌注后2h开始下降，6h达到最低值后开始回升，并持续至72h；SB组各时点KU70表达介于PO组和IR组之间，表达趋势与IR组一致。见表上述结果表明，P38抑制剂SB203580在显著抑制P38MAPK的同时，也显著抑制了KU70的表达。讨论脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏，细胞信号转导通路的激活或抑制4 5，DNA损伤与修复1 6等有关，这些因素通过相同或者不同的途径引起神经元细胞的坏死和/或者凋亡，产生再灌注损伤。在脑缺血再灌注早期，神经元死亡的方式主要是坏死，而迟发性神经元死亡的主要机制是细胞凋亡。临床上常常遇到的低血压、休克、心跳骤停等病人，经过积极的抢治后，尽管呼吸心跳恢复，但常遗留不同程度的脑机能障碍，这主要与迟发性的神经元细胞凋亡有关。 缺血引起的结肠癌细胞发生凋亡，可以被p抑制剂SB203580抑制7；体内及培养的胰腺癌细胞凋亡时，p38MAPK活性增强8 ；神经生长因子（NGF）可促进PC12细胞存活，清除NGF则细胞内p38MAPK持续活化，细胞出现凋亡，而p抑制剂SB203580可抑制清除NGF导致的PC12细胞凋亡，这些试验均支持P38MAPK的激活介导了细胞凋亡。Kevin等9在沙土鼠缺血模型中发现，信号转导通路P38MAPK及其底物ATF2、MAPKAP2在脑缺血后数天持续活化，于至天活性最高，同时海马区锥状神经元同期缺损最多。另有实验表明，通过抑制P38MAPK通路可显著减少大鼠脑缺血后海马CA1区的凋亡神经元。这进一步说明p38MAPK的活化与海马区神经元细胞的凋亡密切相关。DNA损伤修复是影响细胞存活和死亡的主要原因10。多种因子引起的DNA双链断裂(DSBs)，若不进行及时的修复，将引起细胞的死亡。已有实验证明，一些哺乳动物不能进行DSBs修复的原因是DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）成分KU的缺失。该酶至少由两个蛋白质组成：含有催化亚基的p350和双链DNA作用的Ku自身抗原，后者是一个分子量为70/80ku(kD)的二聚体。DSBs修复的酶学机制是：70/80ku的二聚体结合DSBs的断端，然后由于催化亚单位的作用，使得必需蛋白质磷酸化，将断端重接起来。已有试验证明，在脑缺血再灌注损伤中，DNA修复酶KU70参与了细胞凋亡的发生1。另有实验证明，DNA修复酶XRCC1,Ref-1亦参与了脑缺血再灌注损伤时细胞凋亡的发生6 11然而，包括38MAPK信号转导通路和DNA损伤修复在内的多种机制参与了脑缺血再灌注损伤时的细胞凋亡，这些机制相互关联，相互影响，形成了一张复杂的庞大的网络系统。、在这些机制中，到底那一个是主导机制，目前还不清楚。因此，有必要对此进行更深入的研究。本试验结果表明， P38MAPK信号转导通路的激活，DNA修复酶KU70的表达下调促进了细胞凋亡，从而加重大鼠脑缺血再灌注损伤。并且，本试验首次证明，缺血再灌注时，利用P38特异性抑制剂SB203580抑制P38MAPK信号转导通路的激活，同时抑制了DNA修复酶KU70的下调，减轻了再灌注损伤时的细胞凋亡。磷酸化P38表达趋势与细胞凋亡趋势一致，即在再灌注后2h开始升高，24h达到峰值后开始下降，至72h降至最低。然而KU70于再灌注2h开始下降，6h降至最低后便开始回升，早于磷酸化P38和细胞凋亡的回升。这表明， P38信号转导通路激活后可通过下调DNA修复酶KU70以及其他途径而参与缺血再灌注损伤。这些其它的可能途径有：(1)激活c-jun和c-fos;(2)诱导bax转位;(3)介导Caspases的活化;(4)上调TNF-A的表达;(5)增强c-myc表达;(6)磷酸化P53;(7)参与Fas-FasL介导的凋亡。至于P38MAPK是如何调控DNA修复酶KU70，将有待进一步研究和证实。参考文献1 Liu Jingli,Dong Weiwei,Li Jinpin . Chin J Neuroimmunol&Neurol 2004,Vol.11,No.2: 91-932 刘智良，徐如祥，尹震，等。抑制p38MAPK通路对大鼠癫痫发作引起海马神经元损伤的保护作用。中国临床康复，2004，8(16)：3063-30653 Seung-Woo Kim, Young-Mi Yu, Chun Shu Piao,et al. Inhibition of delayed induction of p38 mitogen-activated protein kinase attenuates kainic acid-induced neuronal loss in the hippocampus. Brain Research.1007(2004):188-1914 Lennmyr F, Karlsson S ,Gerwins P ,et al. Activation of mitogen-activated protein kinase in experimental cerebral ischemia J .Acta Neurol Scand ,2002,106(6):333-3405 Simi A ,Ingelman-Sundberg M, Tindberg N. Neuroprotective agent chlomethiazole attenuates c-fos ,c-jun,and AP-1 activation through inhibition of p38 MAP kinase J .J Cereb Blood Flow Metab ,2000,20(7):1077-1088 6 方传勤，周华东，高长跃，等。大鼠脑缺血再灌注后DNA单链断裂与XRCC1的表达变化。第三军医大学学报，2004,26(18):1664-16667 Miki H, Yamada H , Mitamura K . Involvement of p38 MAP kinase in apoptotic and proliferative alterative in human colorectal cancersJ .Anticancer Res,1999;19(6B):5283-52918 Maa SH, Wang CH, Lin CY,et al. Endogenous nitric oxide downregulates the Bcl-2 expression of eosinophils through mitogen-activated protein kinase in bronchial asthmaJ. J Allergy Clin Immunol ,2003;112(4):761-767 Kevin MW, Richard D,Becky A ,et al. Activation of p38MAPK in microglia after ischemiaJ.J Neurochem,1998,70(4):1764-1767 10 李雨民，杨凤桐。DNA损伤修复与细胞凋亡。国外医学放射医学核医学分册，1998,23(3):112-11511 张在强，龙洁，李小玲。局灶性脑缺血神经细胞DNA损伤。中国病理生理杂志，2003,19(3):383-385（附表见下页）表大鼠海马CA1区凋亡指数的变化（s %）组别2h6h12h24h48h72hPO1.540.581.570.641.520.621.570.721.590.501.620.49IR8.550.39*14.414.23*29.276.31*38.363.26*33.242.29*21.615.38*SB5.261.09#9.632.01#15.373.61#21.534.71#18.353.23#12.562.42#与PO组相比，*p0.01 与PO组相比， #p0.01 与IR组相比p0.01表 磷酸化P38在大鼠海马CA1区的表达（s）组别2h6h12h24h48h72hPO198.170.65200.823.18198.772.78198.532.30200.183.38198.031.57IR162.971.91*152.775.30*149.561.63*140.976.72*163.382.70*167.790.93*SB173.141.98#160.000.92#157.501.03#154.330.72#170.071.16#176.681.10#以上数值为灰度值，灰度值越高代表表达水平越低。与PO组相比，*p0.01 与PO组相比， #p0.01 与IR组相比p0.01表 KU70在大鼠海马CA1区的表达（s）组别2h6h12h24h48h72hPO162.752.14163.311.50162.692.77162.892.96163.451.72163.472.01IR182.240.62*195.300.74*192.450.49*190.550.57*187.630.8