《分子生物学讲稿》doc版.doc

分子生物学讲稿陈耕夫副教授绪论一、分子生物学分子生物学是从分子水平来研究生命现象的科学。其核心内容是通过生物的物质基础核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构，功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命现象的分子基础，从而探索生命的奥秘。分子生物学是现代生命科学的“共同语言”。二、分子生物学的任务1. 核酸的分子生物学是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。2. 蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子蛋白质的结构与功能。3. 细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。三、分子生物学与现代医药科学的关系在发病机制方面的研究应用、在疾病诊断中的应用、 在疾病治疗中的应用、 在个体识别中的应用、 在医药工业领域的应用，等等。第一章 核酸的分子结构、性质和功能一、核酸是遗传物质（一）核酸的种类和分布分布：DNA：主要分布在细胞核（或类核区）、线粒体、叶绿体RNA主要分布在细胞质中（二）核酸是遗传物质DNA是遗传物质的证据：肺炎双球菌的转化试验、噬菌体感染实验等。RNA是遗传物质的证据：烟草花叶病毒M和HR品系的重建试验 二、DNA的结构与功能（一）DNA的一级结构与种属的差异DNA一级结构指的是脱氧核苷酸在DNA链中的组成和排列顺序。DNA一级结构的不同是物种间差异的更本原因。除了少数RNA病毒外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。核酸一级结构的书写方式。（二）DNA的二级结构具有多样性1. 双螺旋结构是DNA二级结构的主要类型DNA双螺旋结构主要有A、B、Z等三种类型，染色体在大多数时候以B型DNA形式存在。B型DNA二级结构特点：两条脱氧核酸链构成右手双螺旋结构，链的走向相反；磷酸脱氧核糖链在螺旋的外侧，碱基在螺旋的内侧；脱氧核糖平面与碱基平面相互垂直；碱基配对规律：A=T、GC；稳定力横向是氢键；纵向是碱基堆积力。2. 三链DNA（Triplex DNA）结构当DNA发生重组时，单链DNA侵入DNA双螺旋局部区域可以形成三链DNA结构。DNA双螺旋中，多聚“嘌呤核苷酸-嘧啶核苷酸”是形成三链结构的结构基础。第三条单链为多聚“嘧啶核苷酸-嘌呤核苷酸”序列，则与双链DNA的碱基形成Hoogsteen配对。3. 四链DNA（Quadruplex DNA）结构真核生物DNA3-末端是富含GT的多次重复序列，因而自身形成了折叠的四链DNA结构。（三）DNA的超螺旋结构（三级结构）1. DNA超螺旋结构的概念超螺旋结构(superhelix 或supercoil)：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。超螺旋结构又分为正超螺旋核负超螺旋：正超螺旋(positive supercoil)：盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。 负超螺旋(negative supercoil)：盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。 2. 原核DNA超螺旋结构原核DNA也能与相应的核蛋白结合形成超螺旋结构，但其与蛋白质结合没有特点的结构特点。3. 真核DNA超螺旋结构真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。DNA双螺旋有规律地盘绕组蛋白形成核小体，再进一步的多次盘绕，最后形成染色体。三、RNA的结构与功能（一）mRNA、tRNA、rRNA1. mRNA和hnRNAmRNA的功能是通过三联体密码子指导蛋白质的生物合成。真核mRNA与原核mRNA在结构上有很显著的差别。真核mRNA结构及功能特点：（1）转录在细胞核进行，翻译在细胞浆进行；（2）hnRNA含内含子，需切除内含子连接外显子才成为有活性的mRNA；（3）一条mRNA只能翻译出一种蛋白质；（4）5有帽子结构：与真核mRNA抗5核酸外切酶及正确识别翻译起始位置有关；（5）3有尾巴结构：与mRNA从细胞核转移到细胞浆及mRNA半衰期有关。2. tRNAtRNA的主要功能是在蛋白质合成过程中根据密码子的指引，搬运正确的氨基酸至翻译位置，起着翻译“适配器”的作用。tRNA二级结构特点、三级结构特点。（1）氨基酰tRNA合成酶是翻译保真性的保证其翻译保真性主要依赖于：氨基酰-tRNA合成酶具有酶的高度特异性，通过识别氨基酸与tRNA上的特殊部位（又称为副密码子或鉴别元件）来保证氨基酸与相应tRNA的正确链接；氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性，即带有相应反密码子的tRNA如果连接上错误的氨基酸，则氨基酰-tRNA合成酶不会把错误链接的氨基酰-tRNA释放到溶液中，而是将错误的氨基酸水解掉。副密码子：tRNA分子上能被氨基酰tRNA合成酶识别、决定了该tRNA携带何种氨基酸的核酸序列，称为副密码子（paracodon）。（2）细胞内tRNA组成的特点含不同反密码子的tRNA可以携带相同的氨基酸。由于有的氨基酸可有多个密码子为其编码，因此需要数种tRNA做载体。而能识别同种氨基酸但反密码子不同的多种tRNA互称为同工tRNA (analogy tRNA)。含相同反密码子的tRNA结构可以不同：含相同反密码子的tRNA也有多种，他们结构差异很大，有些含量很高，称为多数tRNA (major tRNA); 有些含量很低，称为少数tRNA (minor tRNA)。3. rRNA数种rRNA与数十种蛋白质组成的核蛋白体是蛋白质合成的“装配机”，是合成蛋白质的场所。核蛋白体由小亚基和大亚基组成。大、小亚基的功能为：（1）小亚基：负责序列的特异性识别，如起始序列的识别、起始密码子的识别等；（2）大亚基：AA-tRNA的结合、肽键的形成、转位等酶反应； （3）rRNA：不同rRNA具有不同的功能。如5S rRNA可以识别tRNA中的TyC；16S rRNA识别SD序列等等。（二）其他小分子RNA1. 不均一RNA（hnRNA）：真核细胞成熟mRNA的前体。2. 核小RNA（snRNA）：参与hnRNA的剪接、转运。这类RNA富含修饰尿嘧啶残基而被命名为U系列snRNA，如U1-snRNA、U2-snRNA等。3. 核仁小RNA（snoRNA）：参与rRNA的加工、修饰。4. 胞质小RNA（scRNA、7L-RNA等）：蛋白质在内质网定位合成的信号识别体的组成成分（三）起始RNA和指导RNA起始RNA（iRNA）：DNA合成时首先合成的一个短的RNA片段作为引物，引发DNA聚合酶活性，启动DNA的生物合成。这个片段称之。指导RNA（gRNA）：在RNA编辑过程中，作为模板介导RNA编辑。其含有进行RNA编辑的编辑区序列信息。（四）端粒RNA与端粒酶端粒为真核生物线性染色体末端的一种特殊的结构，与真核染色体末端的复制、防止染色体末端融合、重组、降解有关。端粒中的主要成分是端粒酶，其组成为：端粒酶RNA (hTR)、端粒酶协同蛋白 (hTP1)、端粒酶逆转录酶 (hTRT) 。端粒酶的作用机理爬行模型。（五）核酶（ribozyme）具有酶类似催化活性的RNA。其活性的保持需要一种特定的构象，如“锤头结构”。依据其特定构象可以人工合成具有催化活性的核酶。四、反义核酸及药物（一）反义核酸的概念及功能反义核酸（antisense nucleic acid）是指根据碱基互补原理，利用人工合成或生命有机体合成的与特定核酸链互补的DNA或RNA片段。反义核酸与目的（靶）序列核酸结合，通过空间位阻效应或诱导RNAase活性的降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的（靶）基因的表达。（二）反义技术与药物1. 反义DNA：正常DNA片段、甲基磷酸型DNA片段、硫代磷酸型DNA片段、双硫代磷酸型DNA片段、a-构型DNA片段等。2. 反义RNA3. 肽核酸第三代反义寡核苷酸药物4. 核酶五、RNAi（RNA干扰）（一）RNA干扰的概念某些小片段RNA具有同蛋白质调节因子一样的能够使相应的基因表达下调作用，这种调节作用称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。其本质为一种RNA能够有效地控制另一种RNA的翻译活性。这些RNA单链的长度很小，一般只有20-25个核苷酸组成，故又称为小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）。（二） RNA干扰的基本原理（1）siRNA与mRNA5端或3端结合，抑制翻译的正确起始、终止过程；（2）siRNA与mRNA结合为双链结构后，成为双链RNA酶的作用靶标，mRNA被双链RNA酶降解。（三）RNAi的应用基因疾病的治疗；肿瘤疾病的治疗；病毒疾病的治疗；研究基因的工具，等等。六、病毒核酸（一）什么是病毒？病毒是一类亚显微专属性的细胞内寄生物。病毒应该具有如下特征：1. 病毒粒子由蛋白质和核酸构成；2. 病毒粒子是由预先形成的组分装配而成，自身不能进行“生长”(细胞分裂)；3. 病毒自身不具备能量代谢的遗传信息，在能量代谢上绝对依赖于宿主细胞；4. 病毒自身同样不具备物质代谢的遗传信息，如蛋白质，核酸等生物分子的生物合成场所（或条件），这也依赖于宿主细胞。（二）病毒核酸的一般特征1. 病毒核酸的分子量差别显著；2. 病毒核酸可以以DNA、RNA的单链、双链或线形、环形等多种形式存在；3. 病毒的基因组较小，但编码蛋白质的种类却较多。往往同一段核酸链可以翻译出几种多肽；4. 寄生原核生物的病毒基因结构与原核生物基因结构相似，如没有内含子；寄生真核生物的病毒结构与真核生物基因结构相似，如含有内含子等。（三）DNA病毒核酸的结构大多数动物病毒含有双链DNA；双链环形DNA病毒，没有游离的DNA末端，对某些DNA外切酶有抵抗性，不易被降解；双链线形DNA病毒，其DNA链末端有某些特殊 结构，如粘性末端、末端重复序列、末端回文结构、双链末端共价键相连（如痘苗病毒）、末端连接蛋白质（如腺病毒）等。（四）RNA病毒核酸的结构RNA携带其全部遗传信息，病毒基因组大小存在明显差别；有些RNA病毒在形成mRNA时也有类似于DNA病毒的剪接，因此在RNA病毒中也可有一段RNA编码不止一种蛋白质；绝大多数的RNA病毒为单链线形，但也有少数双链RNA，目前还发现了环状病毒（d病毒，HDV）。病毒若具有mRNA功能，称为正链RNA病毒，其核酸具有真核mRNA 的结构特点。病毒互补链起mRNA功能，称为负链RNA病毒。逆转录病毒为正链RNA、单链、有帽尾结构。第二章 基因与基因组一、基因的概念（一）基因概念的发展19世纪孟德尔：生物体的某一特定性状是受一个遗传因子所控制；1926年摩尔根基因论：遗传因子是在特定的染色体上直线排列的遗传颗粒；1928年Griffith肺炎球菌转化实验：证实DNA是遗传物质；1944年Avery用生物化学的方法证明转化因子是DNA而不是其他物质；1953年 Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，明确了DNA的复制方式；1957年Crick提出中心法则；1957年Benzer提出顺反子概念；1961年Gamow提出三联体遗传密码，从而将DNA分子结构与生物体蛋白质合成结合起来；1961年Jacob和Monod提出了操纵子学说，阐明了基因在乳糖利用中的作用。（二）基因的分子生物学定义基因是指DNA分子中能编码一条多肽链或RNA链，并具有一定长度的DNA片段。一个完整的基因应包含编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，及保证转录所必需的非编码蛋白质的调控序列，即前导区序列和尾部区序列。（三）基因存在的一些形式1. 重叠基因原核生物的同一段DNA片段能够编码两种或者多种蛋白质分子。基因重叠方式有：一个基因完全在另一个基因里面；部分重叠；两个基因只有一个碱基重叠。2. 断裂基因真核生物基因中有很多序列不具有编码功能，如重复序列、间隔序列、内含子等，这种基因存在形式称为断裂基因。内含子的结构特点：1. 不同基因内含子的大小和多少不同；2. 内含子具有相对性，即一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子 。断裂基因的生物学意义 ：（1）有利于储存较多的遗传信息（如SV40的T和t蛋白）；（2）有利于变异和进化，若在交界顺序处发生突变，就可能影响正常的剪切方式，从而使蛋白的结构发生较大的变化；（3）有的内含子可编码内切酶。 3. 复等位基因一个座位上的基因，因突变而产生两种以上的等位基因，他们都影响同一性状的状态和性质，这个座位上的一系列等位基因总称为复等位基因。如人的ABO血型就是由一组复等位基因决定的，这一组复等位基因是IA、IB、i 三个基因。但是,对每个人来说,只可能具有其中的两个基因。因此基因型为IA/i或IA/IA表现为A型血、IB/i或IB/i表现为B型血、IA/IB表现为AB型血、i/i表现为O型血。4. 假基因对不能转录的或转录后生成无功能的蛋白质的基因。假基因在基因组中形成稳定的和无活性的拷贝，由活化的原始基因突变而来（复制突变或者加工型假基因），这是因为存在着在某个阶段伤及基因表达的一种或多种缺陷（如启动子错误、有缺陷的剪接信号、框架中有终止信号等）之故。二、原核生物基因特征1. 功能相关的基因高度集中，即功能上密切相关的基因构成操纵子；2. 编码蛋白质的基因通常以单拷贝的形式存在；3. 编码rRNA的基因常是多拷贝的；4. 基因具有连续性，不含居间序列；5. 细菌中DNA大部分用于编码蛋白质，只有很少不编码的DNA序列；6. 细菌的结构基因重复序列少。三、真核生物基因特征1. 基因不连续性指在DNA分子上基因的编码序列是被不连续的非编码的序列所隔开的基因。DNA分子中编码mRNA某一部分序列的区域称为外显子，不编码的序列称为内含子。2. 基因家族真核生物的基因组中有许多来源相同，结构相似，功能相关的基因，这样的一组基因称为基因家族。基因家族又分为基因家族和超基因家族。基因家族分为串联重复基因（如rRNA、 tRNA和组蛋白基因家族等）和分散式基因簇（如血红蛋白基因家族）；超基因家族：由基因家族与单基因组成的较大的基因家族。超基因家族的结构同源性不等，虽起源相同，但功能不同（如免疫球蛋白基因）。3.重复基因结构真核细胞DNA中含有一些重复序列，这些重复序列短的由35个核苷酸组成，长的可达50006000个核苷酸。而且不编码的区域多于编码区域。根据这些重复序列出现的频率分为：低度重复序列（仅重复一次或数次）、中度重复序列（重复数为几十至数万，如Alu家族） 、高度重复序列（重复数达106，如反向重复序列、卫星DNA等）。4. 除配子细胞（卵子、精子）外，体细胞内的每个基因都是双份的，即有两份同源的基因（等位基因）；5. 一个结构基因经过转录和翻译仅生成了一个mRNA分子和一条多肽链。四、细胞器基因特征线粒体DNA特征1. 绝大多数生物的线粒体DNA（mtDNA）是双链的超螺旋环状分子，但两条链的碱基组成不同，一条链富含嘌呤称为重链；另一条富含嘧啶称为轻链；2. 线粒体DNA为母系遗传；3. mtDNA的复制属于半保留复制，可以是型复制、滚环复制、D-环复制。五、亚细胞结构基因特征病毒DNA特征1. 病毒中核酸只有一种，或者是DNA或者是RNA；2. 大部分病毒核酸是一条单链或双链分子，只有少数病毒由几个片段组成；3. 病毒核酸大小差异很大；4. 病毒基因组中含有启动子和操纵基因；5. 噬菌体基因中无内含子，但感染真核细胞的病毒基因组中有内含子；6. 病毒中有重叠基因存在。六、癌基因与抑癌基因（一）癌基因（oncogene）1. 癌基因的概念细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。癌基因又分为原癌基因和病毒癌基因。原癌基因：存在于生物正常细胞基因组中的癌基因，也称细胞癌基因（cellular oncogene，c-onc）。病毒癌基因（virus oncogene，v-onc）：存在于病毒基因组中的癌基因，它不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使细胞持续增殖。2. 原癌基因的分类（按功能分类法）（1）生长因子：如sis、mos等基因，分别编码血小板生长因子和前表皮生长因子；（2）生长因子受体：如erbB和erbA等基因；（3）蛋白激酶：如sre、yes、abl和ros等基因，该类基因编码的蛋白质具有酶活性；（4）ras基因：如H-ras、K-ras和N-ras等基因，编码的蛋白为鸟苷酸结合蛋白，具有GTP酶活性；（5）核蛋白：如myc、fos和jun等基因，编码的蛋白质位于细胞核内，控制基因表达和转录。3. 原癌基因激活机制（1）点突变：导致蛋白质结构变异，功能异常；（2）原癌基因扩增：DNA复制时导致原癌基因拷贝数增加，编码的蛋白质水平增加；（3）基因重排：原癌基因在染色体易位时重排至强启动子或增强子附近而活化，原癌基因表达增强；（4）原癌基因缺失：原癌基因小片段的缺失，其编码的异常蛋白质导致细胞过度增值；（5）获得启动子和（或）增强子：逆转录病毒整合入细胞DNA后，带入启动子和增强子而诱发原癌基因高表达。（二）抑癌基因（anti-concogene）：1. 抑癌基因的概念抑癌基因是正常细胞分裂、生长的负性调控基因，其编码的蛋白质抑制细胞增殖。2. 抑癌基因的功能（1）拮抗癌基因；（2）参与细胞周期调节；（3）监控细胞基因的完整性，修复突变基因，或使无法修复的细胞进入程序性死亡。3. 抑癌基因失活的主要原因抑癌基因失活是肿瘤形成过程的一个重要因素。其失活的主要原因有：（1）基因突变：基因水平上的缺失、插入、重组等；（2）基因正常，但基因产物缺失或极低：可能是转录、转录后加工、翻译、蛋白质降解出现异常所致；（3）基因产物正常，但不能发挥功能，如存在蛋白质变构抑制剂等所致。4. 常见的抑癌基因5. 癌基因、抑癌基因、生长因子的关系癌基因的产物一般为生长因子，而生长因子是细胞增殖的正调节信号；抑癌基因产物为细胞增殖的负调节信号；生长因子与抑癌基因产物的作用处于动态平衡，细胞保持正常的增殖状态。当生长因子与抑癌基因产物的作用动态平衡被破坏，生长因子作用增强或抑癌基因产物作用减弱，均导致细胞的无限增殖导致癌变。七、基因组（一）基因组的定义基因组是指细胞中一套完整单体的遗传物质的总和。对于细菌和噬菌体而言，基因组是指单个染色体上所含的全部基因。对于二倍体真核生物的基因组则是指维持配子或配子体正常功能的最基本的一套染色体及其所携带的全部基因。（二）基因组的结构特点1. 原核生物基因组结构特点（1）基因组较小，平均1kb，在大小上变化不大；（2）几乎无蛋白与核酸结合；（3）有操纵子结构；（4）基因绝大多数为单拷贝形式，部分为多拷贝形式，但拷贝数一般很低；（5）有重叠基因，但结构基因部分无重叠现象；（6）多顺反子。2. 真核生物基因组结构特点（1）基因组较大，高等生物与低等生物基因组大小上差异很大；（2）和蛋白质结合，形成染色体，而且有多条；（3）有重复序列；（4）以单拷贝与多拷贝两种形式存在；（5）基因不连续，存在内含子与外显子；（6）DNA片段可以重排；（7）单顺反子。3. 线粒体基因组结构特点（1）不同生物的线粒体基因组大小各不相同；（2）每个线粒体中含有多个拷贝的mtDNA分子；（3）基因数目和排列顺序相同，共有2个rRNA基因、22个tRNA基因、13个线粒体膜蛋白基因和1个氧化代谢所需基因；（4）有两个复制起始点；（5）某些蛋白质的密码子与核基因通用密码子不同；（6）氧化磷酸化所需的酶大部分亚基由核基因编码，仅少数由mtDNA编码。4. 细胞器基因组（质粒）结构特点（1）基因组为环状，并有多个拷贝；（2）基因组常以重组产生的序列变异体混合物的形式存在；（3）绝大多数都有基因表达功能；（4）有多个转录起始点，为多顺反子；（5）非细胞生存必须的基因组，但其存在能为细胞带来新的生物学表型；（三）遗传图谱、物理图谱、基因图谱1. 遗传图谱（genetic map）以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。2. 物理图谱指以一段已知的核苷酸序列的DNA片段（sequence tagged site，STS，序列标记位点）为“路标”，以Mb或kb为图距的基因组图。STS一般为100-500bp的DNA片段，只在整个基因组或染色体中出现1次，以保证“路标”的可靠性。3. 基因图谱鉴别人类目前认为的全部3万4万个基因，并了解各个基因核苷酸的序列。（四）人类基因组及人类基因组计划1. 人类基因组的概念是指人类细胞所包含的DNA结构的一整套基因，携带着决定生物特性的全部遗传信息，即记录基因组全部DNA序列。2. 人类基因组计划的意义全面而透彻地认识人类基因组的正常结构、功能及基因异常结构（变异）与人类疾病。 对生命进行系统地和科学地解码，以达到了解和认识生命的起源、种间和个体间存在的差异的起因、疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象的目的。3. 人类基因组计划研究的内容（1）人类基因组DNA全部序列的测定；（2）基因DNA序列的识别和正常功能，基因变异与人类疾病的研究。4. 人类基因组的多态性与基因组药学药物基因组学研究包括治疗效果和药物反应不同造成的个体差异，及每个个体基因组上所存在的与药物作用的不同疾病靶点分子的情况。最终将从目前药物研究主要依据患病人群共性来设计的思路转变为依据人群或不同个体的遗传特征来设计药物的新方向，即医药个体化或医药家庭化。5. 后基因组计划：通过了解基因表达模式的研究，最终了解基因组的功能。（1）结构基因组学：研究基因和基因组的结构、各种遗传元件的序列特征、基因组作图和基因定位等。 （2）功能基因组学：着重研究不同序列结构具有不同功能、基因表达的调控、基因和环境之间（包括基因与基因之间、基因与其它序列之间、基因与蛋白质之间）相互作用等。 （3）转录物组学：研究转录物组的一门学科，即研究某一时刻某一细胞里基因组转录产生的全部转录物的种类、结构和功能。 （4）蛋白质组学：研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的一门学科，它是1994年提出的。 （5）表型组学：研究生物体整个表型形成的机制。第三章 可移动的遗传因子和染色体外的遗传因子一、转座子（Transposon）（一）转座子的概念在原核生物和真核生物基因组中存在着可以从一个部位转移到另一个部位的一些DNA序列，这些序列称为转座子。DNA到DNA移动过程称为转座。与其他大多数基因组重建方法不同的是，转座子不依赖于供体和受体位点序列间的任何关系，仅依赖自身结构特点转座到同一基因组内的新位置。（二）转座子的分类和结构特征1. 转座子的结构特征转座子具有保守结构，在转座子的结构中含有一个或多个开放阅读框，在阅读框的两侧有反向末端重复序列(inverted terminal repeats, ITR)。在开放阅读框中至少含有转座酶基因，转座酶可识别ITR，产生转座效应。转座子特点：（1）两端有反向重复序列；（2）转座后靶序列是正向重复；（3）转座子编码了转座有关蛋白；（4）可以在基因组中移动。2. 转座子的分类（1）原核生物转座子的分类插入序列（insertion sequence ，IS ）：两端有ITR，只编码转座酶；类转座子：结构同IS，但不能独立存在，仅作为复合转座子两端的组件；复合转座子：两端由IS或类IS构成，可编码抗性物质；TnA转座子家族：两端为ITR，可编码转座酶、解离酶和抗性物质。（2）真核生物转座子的分类转座子：如植物Ac-Ds、果蝇P因子等；逆转录转座子：逆转录病毒、病毒超家族及非病毒超家族等3. 插入序列（IS）IS是最简单的细菌转座子，IS含有的碱基数较少，在插入序列中间一般只含有一个转座酶基因，整个转座子的长度也比较小（750-1500bps）。IS的转座首先由转座酶交错切开宿主靶位点，然后IS插入，并与之连接，余下的缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，结果使插入的IS两端形成短的正向重复靶序列。4. 复合转座子在两个相同的插入序列中间含有其它蛋白基因（如耐药性基因），可与转座子一同发生转座，这类转座子称为复合转座子。5. 转座子A家族（transposon A，TnA）是一类除了带有和它的转座作用有关的基因以外，还带有编码解离酶、耐药性基因等其他蛋白基因的转座子，其长度约5kb。TnA的特点为：（1）末端反向重复序列(IRT)约为38bp，两端中任一个的IRT突变或丢失都会阻止转座；（2）TnA对靶点的选择有区域特异性，但在优先区域内的选择则是随机的；（3）转座子内含转座酶、解离酶及其它蛋白基因；（4）转座子内一般含有一个解离序列（res）；（5）靶序列产生5bp同向重复序列。6. 转座噬菌体(Mutator phage )即诱变噬菌体，是一种以溶菌和溶源菌周期性交替方式生长的感染大肠杆菌的温和噬菌体。含有噬菌体生长繁殖和转座所必需的基因，但并没有固定的整合位置。（三）转座子的转座机制1. 非复制型转座转座子直接从一个位点转移到另一个位点的转座方式。整个过程只需要转座酶识别转座靶点的核苷酸序列，并将转座子在原处剪下后，插入靶序列，靶序列被复制为正向重复序列。供体转座后留下的双链DNA缺口由宿主修复系统识别并加以修复。如果供体留下的缺口未被修复，则会导致细胞致命性伤害。2. 保守型转座也属于非复制型转座，但转座子从供体位点上切下来然后插入靶位点，供体位点即恢复原状。3. 复制型转座（1）复制型转座的概念转座反应中，转座子被复制，移动的转座子是原转座子的一个拷贝，原转座子保留在原位点，而另一个拷贝则插入新的位点，因此转座伴随着转座子拷贝数的增加。复制型转座除了需要转座酶外，还需要解离酶的参与。（2）复制型转座的机制对称模型（3）复制型转座的机制非对称模型4. 转座频率的控制转座子为了存活必须维持一定的最低移动频率；如果移动频率过高，则会伤害宿主细胞。 每个转座子都有调控其转座的机制，主要通过反向重复序列的特异性、甲基化修饰、靶序列特异、转座酶的表达等实现转座频率的调控。（四）转座效应引起DNA重排1. 转座的遗传效应（1）转座引起插入突变，导致受体基因失活；（2）转座给受体DNA带来新的基因；（3）转座产生的染色体畸变；（4）影响基因表达；（5）转座引起的生物进化。2. 转座的结构效应转座子将其一份拷贝插入原来位点附近的第二个位置时，两个转座子间将可能造成重组：（1）转座子两端有正向重复序列：转座子中间的DNA序列切除；（2）转座子两端有反向重复序列：两个转座子间的序列被反转；（3）邻近两个转座子引起的基因重排，这种重排不是由转座酶引发的，而是由细菌内的其他酶识别转座子内的同源序列而产生的重排。（五）逆转录病毒和逆转录转座子1. 逆转录病毒基因组与逆转录转座子结构逆转录病毒为正链病毒，在一个病毒颗粒内含有两条RNA链，为双倍体的病毒颗粒逆转录病毒的生活周期为：RNA DNA RNA。逆转录生成、可整合到宿主中的DNA序列，称为原病毒。真核生物的有些转座子和他们组织中逆转录病毒的原病毒有关，而且它们的转座是RNA介导的，这类转座子称为逆转录转座子（retransposon）。（1）逆转录病毒基因组典型的逆转录病毒由三条基因gag-pol-env组成，每条基因经加工能产生多种蛋白质。其中gag编码病毒种族特异性的抗原；pol编码逆转录酶；env编码病毒外膜蛋白。病毒RNA末端有同向重复序列称为R序列；5端序列称为R-U5、3端的序列称为U3-R。逆转录病毒基因组及基因表达（2）逆转录转座子结构逆转录转座子与逆转录病毒在结构上有许多相似之处，如同向长末端重复序列、每个重复序列的两侧是短反向重复序列、含有gag、pol基因的同源序列等。（3）逆转录病毒与转座逆转录病毒RNA在逆转录为DNA的过程中在5端加了U3序列、在3端加了U5序列，则在DNA两端形成了U5-R-U3的两个相同的长末端重复序列。长末端重复序列被整合酶识别，并催化病毒DNA整合入宿主DNA序列中。长末端重复序列的突变将抑制病毒DNA的整合。（4）逆转录病毒与转录逆转录病毒可以转导真核细胞的序列，成为“转导逆转录病毒”，其实质是一种获得细胞部分序列的病毒变种。由于转导逆转录病毒的部分序列被v-onc（病毒癌基因）取代，导致复制能力缺陷，在宿主细胞内不能单独复制，但在辅助病毒的帮助下仍可不断增殖。2. 逆转录转座子的三种类型（1）病毒超家族（viral superfamily）是以不产生感染性颗粒的RNA为中间体进行转座的一类转座子。含有与逆转录病毒相似的LTRs，可以编码逆转录酶和（或）整合酶，转座行为类似逆转录病毒的复制，但不经过独立感染形式。如酵母菌的Ty元件、果蝇的copia元件。（2）LINES家族（long interspersed elements，长散布元件）这类转座子含逆转录酶活性，但缺少LTR，是以不同于逆转录病毒的机制来引发逆转录反应。这一家族的部分成员能自发转座，而大多数是在反式作用于自主元件的作用下才能转座。如L1元件、DNA聚合酶II转录物的假基因等。（3）非病毒超家族（nonviral superfamily）这类转座子的外在和内在特征说明他起源于RNA序列，但不含LRT，也不编码任何蛋白。他们需要依靠其他因子才能转座，包括转座所需的逆转录酶，故这类转座子也称为非自主性逆转录转座子。如Alu元件、Sines、DNA聚合酶III产物的假基因等。（六）真核转座子（自学）1. 玉米中的控制因子麦克林托克的伟大发现 McClintock发现原来的C突变（无色素）是由一个“可移动的控制因子”（现在称转座子）引起的，称为Ds，即解离因子（dissociator），它可以插入到C基因中。另一个可移动的控制因子是Ac，称激活因子（activator），它的存在激活Ds转座进入C基因或其它基因，也能使Ds从基因中转出，使突变基因回复，这就是Ac-Ds系统。2. 果蝇中的P因子“杂种不育”（hybrid dysgenesis）二、质粒（Plasmid）（一）质粒的概念质粒是多数细菌和某些真核生物细胞染色体外的双链环状DNA分子。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性单位。质粒不是宿主所必需的成分，但质粒可以为宿主带来新的遗传性状。在特殊的环境下，如有抗生素存在的情况下，质粒是细菌必需具备的基因。（二）质粒的遗传类型1. F质粒 （F plasmid）性质粒可将宿主染色体基因转移至另一个宿主中（转导作用），它本身转移到缺乏F质粒的细胞后可使后者变成F质粒的细胞。F质粒分子大小为62106Dalton，94.5kb，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与细菌的接合作用有关。2. R质粒 (R plasmid)耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性基因。由抗性转移因子和抗性决定因子两个DNA片段组成。细菌获得这种质粒后能抵抗一种或多种抗生素。R因子又分两类，一是接合性耐药质粒（R质粒），另一是非接合耐药性质粒（r质粒）。3. col质粒(col plasmid)含合成大肠杆菌毒素(colicin)基因的质粒，能杀死不含大肠杆菌毒素的亲缘细菌。col质粒为可转移性质粒，但缺乏生成转移设备（菌毛）的能力，其转移依赖于F质粒提供的接合转移设备，完成自身的转移。4. 质粒噬菌体（噬粒，phagemid）或噬菌体质粒能把完整的质粒引入某种噬菌体DNA成为一种嵌合体，这种嵌合DNA的遗传行为取决于某一个复制子的强弱及是否受阻的情况。质粒噬菌体：嵌合DNA由噬菌体DNA上的复制起点所发动，则表现噬菌体行为。噬菌体质粒：嵌合DNA由质粒所发动，则表现质粒的行为。（三）质粒DNA特性1. 质粒的复制质粒DNA的复制由细菌染色体的多种酶系统来完成，不同的质粒在宿主细胞内采用的酶系统不同，在宿主细胞中的复制程度也有很大差别。所有的质粒均为半保留复制，并在复制周期内保持环状结构。复制形式则具有多样性，有双向复制、单向复制、先单向后双向混合等方式。（1）根据质粒在宿主内复制程度的不同，质粒又分为：严紧型质粒：需要某些蛋白质及DNA聚合酶III参与复制过程，染色体复制停止时停止复制，每个细胞内只有1-5个质粒；松弛型质粒：用DNA聚合酶I完成复制，可以不需要蛋白质的合成反应，染色体复制停止时可以继续复制，每个细胞内有10-200个以上的质粒。（2）根据质粒在细菌中的存在的数量，质粒又分为：低拷贝质粒：在每个细胞内只有1至数个质粒。高拷贝质粒：在每个细胞内有10个以上的质粒，其数量甚至可以高达数百。2. 质粒的不相容性是指不同的细菌质粒不能在相同细胞中同时存在的现象。即当某种质粒在宿主细胞内存在时，将阻止其他类型质粒进入细胞寄宿，这种质粒称为不相容质粒。根据不同质粒在同一细胞中的共存能力，可分为不同的不相容组。含有相同复制子的质粒属于同一个不相容组；而含有不能互换成分的复制子的质粒属于不同的不相容组。3. 质粒的转移性在自然条件下，许多质粒可通过细菌接合的作用，将质粒复制子转移到新的宿主细胞内。但有些质粒由于缺乏转移所必需的基因，因此不能自身完成从一个细菌到另一个细菌的接合转移。4. 质粒中的选择性标记通过人工转化可将质粒DNA导入细菌中，即使在最佳条件下，细菌群中也只有少数细菌能稳定接受质粒。因此，就需要质粒编码的可选择标记来鉴定这些转化的细菌群。常用的选择性标记是抗生素基因，如氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素抗性基因。一般的细菌不能在含有氨苄青霉素或四环素的培养基中生长，但转化了pBR322的细菌可以在含氨苄青霉素或四环素的培养基中生长。（四）真核生物中的质粒动物细胞中是否有质粒，没有定论，但酵母中有质粒存在 。如：杀伤微粒是一个双链RNA分子，分子量为1.5106。其中一些基因用于编码合成类似于大肠杆菌素的杀伤物质。2um质粒的DNA分子长2um，分子量4106，位于细胞核内，有组蛋白包裹。三、遗传重组（Genetic Recombination）（一）遗传重组的概念遗传重组指分别来自两个亲本的基因连锁群间所产生的交换，形成两个亲本所没有的连锁群组合，产生具有重组性状的后代（重组体）的现象。遗传重组主要有四种类型：同源重组、位点特异性重组、转座作用、异常重组。真核生物是具有二套或二套以上的同源染色体的倍数体，所以一般在减数分裂形成生殖细胞时同源染色体之间会发生交叉从而出现重组，如同源重组、转座等。原核生物（病毒和细菌）是以单一的核酸为基因组的单倍体，因此如果进行杂交，两个亲本DNA分子之间就会直接发生交换而形成重组体，如噬菌体的位点特异性重组。（二）同源重组（homologous recombinatio）1. 同源重组的概念同源重组指发生在DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同源DNA序列的交换。在同源重组中只要两条DNA序列相同或相近，就可以在序列的任何一点发生同源重组。负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱基序列特异性要求。2. 同源重组的分子机制Holliday重组模型Holliday模型的基本过程可以概述为：同源DNA链的切断；同源DNA链的交换；交叉DNA链分支迁移；去交叉结构；中间体拆分。不同方向切割Holliday结构得到不同的结果：生成重组体、无重组体生成。3. 同源重组的酶学（以大肠杆菌为例）(1) RecBCD的作用：RecBCD为多功能酶，具有核酸酶活性、解旋酶活性、ATP酶活性。其作用是：识别chi位点(GCTGGTGG),在chi位点把双链DNA解开为单链，并在chi位点下游将解开的DNA单链切开。(2) RecA的作用：RecA又称为重组蛋白，能结合DNA单链或双链。其作用是：在ATP的作用下，使两个DNA分子形成同源配对的联合分子，而联合分子的互补链可以进行链间的交换。(3) Ruv系统的作用： RuvA：识别Holliday连接点结构，在交换点处与所有的四条链结合，形成两个四聚体，将DNA象三明治一样夹住； RuvB：为解螺旋酶，有ATP酶活性，为分叉迁移提供动力； RuvC：为核酸内切酶，识别Holliday连接点，并切开连接点，解开重组中间体4. 同源重组的主要类型(1) RecBCD途径：原核生物染色体主要途径；(2) RecF途径：RecBCD途径的替代途径；(3) RecE途径：质粒途径；(4) Red途径：又称重组缺陷途径，为l噬菌体专用途径。（三）位点特异性重组（site-specific recombinatio）1. 位点特异性重组的概念不依赖于DNA序列的同源性，而依赖于能与某些酶结合的特异DNA序列的存在而进行的基因重组。同源重组与位点特异性重组的区别是：同源重组位点特异性重组重组位点随机特定位点(序列)各基因相对位置不改变改变2. 噬菌体对大肠杆菌的整合3. 免疫球蛋白（抗体）VDJ重排(1) 免疫球蛋白（抗体）的结构抗体有两条轻链和两条重链共四条肽链组成。每条肽链都分成了可变区(V)和恒定区(C)两个区域。(2) 重组信号免疫球蛋白基因的重组通过位点特异性重组方式进行。在每个基因旁有一个保守的七聚体和九聚体组成的回文结构（称为共有序列），中间是非保守的间隔序列，含11个碱基或23个碱基，被称为重组信号序列（recombination signal sequences, RSSs）。这些重排信号序列保证了轻链与重链的正确连接。(3) 重组酶识别V、(D)、J基因片段两侧的共有序列，切断并连接DNA。免疫球蛋白的重组酶的部分成员的基因只在不成熟的淋巴细胞表达，因此，成熟的淋巴细胞不能再进行抗原受体基因的重排。(4) V(D)J重组机制V(D)J的重组连接是不精确的，即在重组过程中经常发生在连接点碱基的丢失和额外碱基的增加，从而使有限的基因片段获得多种表达产物。第四章 DNA的复制、突变和修复一、DNA的复制（DNA Replication）（一）DNA复制的一般特征1. 半保留复制 (semireservative replication)DNA复制是将两条亲本链分开，每一条作为合成新链的模板，按碱基配对的规则合成新链，形成两个子代DNA双螺旋结构。子代DNA的双链中一条是原来的链，另一条是新合成的，称为半保留复制。2. 复制的起点、复制子、复制叉、复制方向、复制终点（1）复制的起始点（origin of replication, ori）复制总是从某一特定的位置开始，这个位置称为复制起始点，有几十甚至几百个碱基的跨度，用ori或O表示。（2）复制子（replicon） DNA分子复制时，并不是整条链全部打开，而是在复制的局部将链解开，形成复制单位，这个复制单位称为复制子。细菌和病毒这些小的染色体，整个DNA分子就是一个复制子。真核生物，有多个复制起始点，同时进行复制。两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子。（3）复制叉（replication fork）DNA分子复制时，在复制起点两条链解开成单链状态，两条单链分别作为模板，各自合成其互补链，这种Y形的结构称为复制叉。冈崎片段：由于DNA合成方向只能是53，而DNA模板双链走向相反，导致一条新合成的DNA可以沿解链方向连续合成，另一条新合成的DNA链只能是模板DNA链解开一段合成一段，这种DNA合成方式又称为DNA的半不连续合成。不能连续合成而形成的DNA片段称为冈崎片段。（4）复制方向（原核生物）大多数原核生物的DNA使用双向复制（bidirectional replication）的方式进行DNA的合成，但有些生物DNA则采用单向复制或不对称的双向复制方式复制。双向复制：是指在DNA合成时在一个复制起始点能形成两个方向相反的复制叉进行复制的方式。单向复制：在一个起始点只形成一个复制叉的复制方式。不对称复制：开始复制时在起始点形成两个复制叉，但一个复制叉提前停止复制，另一个复制叉继续复制至DNA合成结束。（5）复制终点有些有特点的终止点，有的没有特定的终止点。不同生物的终止方式也不完全相同。3. 复制的酶学（1）与复制起始相关的酶 解螺旋酶（DnaB蛋白）：通过消耗ATP将DNA双链解开为单链，有利于复制； 引物酶（DnaG蛋白）：合成一段RNA引物来激活DNA聚合酶； 单链 DNA结合蛋白（SSB） ：稳定解螺旋酶解开的DNA单链； 拓扑异构酶（又分为I型、II型）：解决DNA解链过程中下游DNA打结问题。（2）DNA聚合酶 原核生物DNA聚合酶pol-Ipol-IIpol-III53聚合酶活性+35外切酶活性+53外切酶活性+功 能切除引物填补空隙修复合成可能与DNA损伤修复有关复制的主要酶 真核生物DNA聚合酶DNA聚合酶功能DNA聚合酶功能DNA聚合酶aDNA复制：合成随从链聚合酶bDNA损伤修复DNA聚合酶dDNA复制：合成领头链DNA聚合酶g线粒体DNA复制DN聚合酶e未知：结构类似于