微量元素对红树林内生真菌增殖生长及次级代谢的影响课件

微量元素对红树林内生真菌1403#增殖生长及次级代谢的影响 HPLC/ESI/MS研究分析,年级：02级本科 专业：化学生物学 姓名：梁智斌 指导老师：佘志刚 副教授,红树林（Mangrove）微生物,红树林地理及生态状况特殊性。 红树林真菌资源尤为丰富，次级代谢物生物活性突出，红树林内生真菌次级代谢物药用潜力很大。,一、研究概要,海洋天然产物研究室红树林研究成果,林永成研究小组，1996年在国内率先开展红树林微生物活性物质研究，共采集红树林菌株超过3000株，活性筛选600株,鉴定73株。从已经发酵培养的一百多种菌株中，分离次级代谢化合物311个，新化合物100个，筛选出抗癌活性化合物18个，其它活性物质30个。在国内外重要刊物发表论文共100篇，国际论文46篇，据不完全的统计，课题组的论文被SCI引用超过100次。研究组出版专著两部，申请发明专利12项，其中国际专利PCT 1项，授权6项。在海洋微生物及其代谢产物研究方面处于国内领先地位，与国际同步。 在已经放大培养的真菌中,1403#真菌其代谢产物丰富,已经分离到大量有药理活性的新化合物.,红树内生真菌1403#代谢产物研究情况,红树的内生真菌1403#为盐生坚座壳种（Halorosellinia sp.）真菌 已从中分离出20多种化合物，其中8种新化合物，已申请3项专利，其中2项已授权。这些化合物中大多数具有抗肿瘤、抗菌活性。,菌1403#分离得到的蒽醌和萘醌类化合物对人宫颈癌细胞、人肝癌细胞、人喉癌细胞、大肠癌细胞有显著抗癌活性，其IC50值均低于10g/ml 。 前期研究发现微量元素对菌体生长代谢影响显著。,微量元素营养物对微生物生长影响,微量元素对微生物影响： 1、构成有机化合物，成为菌体成分； 2、作为酶的组成部分，维持酶的活性； 3、调节培养基的渗透压，恒定微生物发育生长的条件。 4、作为自养微生物的能源，供给生命活动所需的能量。,二、实验目的及创新点,优化真菌1403#培养条件，提高次级代谢的种类和含量。 研究微量元素对真菌1403#生长和次级代谢的影响。 运用HPLC-ESI-MS手段对代谢产物进行定性、定量分析，从中发现新的代谢产物。,蒽醌、萘醌类化合物有很好的抗肿瘤活性，改变培养条件可能发现结构新颖、具有药理活性的新化合物； 国内运用LC-MS方法研究海洋微生物的代谢产物文献报道并不多见，但实验证明，此方法是种可行而且可靠的研究手段，不但能提供丰富的数据信息，而且对微生物规模培养及分离提纯等后续研究工作有很强的指导意义。,三、实验部分,（一）微量元素条件下真菌1403#发酵培养跟踪,B、Mn,酒石酸、Fe,Cu、Mo,Zn、Co,Cd、Ni,空白对照,结果与讨论,与空白对照培养（不添加微量元素）相比，含有硼酸、Mn2+、Fe3+、Cu2+的培养基能明显促进菌体生长；含有酒石酸、Mo2+、Zn2+、Co2+的培养基则对菌体生长抑制作用明显；含有Cd2+、Ni2+的培养基对菌体有明显毒害作用，菌体接种后不生长。,含有硼酸、Mn2+、Fe3+的培养基对促进次级代谢物的产生作用显著；含有Cu2+、酒石酸、Mo2+、Zn2+、Co2+的培养基对次级代谢有拮抗作用。 含有硼酸对次级代谢也有显著的刺激。发酵液颜色变得最深，代谢最旺盛。 Cu2+对次级代谢过程有很大的改变，菌体由始至终都没有明显的红色次级代谢物产生。,（二）HPLC定量分析真菌1403#5种次级代谢物含量,标准对照样品,色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱 5m，3.9150mm；流动相:V(甲醇):V(1%冰醋酸溶液)=45:55；柱温为室温；流速1.0mL/min；检测波长254nm/280nm；进样量15L。,标准对照峰判定 精密称取对照样纯品适量，甲醇定容，按上述色谱条件分别进样，记录各物质保留时间；再吸取混合对照样品储备液，进样15L。对照各图谱保留时间，判定化合物归属。,（e）,（d）,（c）,（a）,（b）,标准曲线绘制 化合物(1)：Y=2.31495+0.0000271774*X R=0.99802 化合物(2)：Y=4.30504+0.000173795*X R=0.95762 化合物(3)：Y=-1.24957+0.000468294*X R=0.99364 化合物(6)：Y=2.57425+0.0000330772*X R=0.99865 化合物(11)：Y=1.59166+0.0000176694*X R=0.99901,结果与讨论,硼酸（样A）培养基中能明显刺激化合物(1)(2)(3)的代谢； Fe3+离子（样D）对化合物(3)代谢的促进明显。 Mn2+、酒石酸、Cu2+、Mo2+、Zn2+、Co2+（样B、C、EI）对4种对照化合物的次级代谢有明显的抑制作用。 HPLC实验还发现，所有培养条件所得样品均没有出现化合物(11)信号。 HPLC测试显示，Cu2+培养条件下所得谱图峰形比较丰富，有些峰还为新的未知峰。,（三） HPLC分析3种条件下1403#真菌的代谢物,色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱 5m，3.9150mm；流动相为甲醇、乙腈和0.4%冰醋酸水溶液（pH=3.2）三元梯度洗脱，梯地洗脱见表7；柱温为室温；流速1.0ml/min；检测波长254nm/280nm；进样量15L。,结果与讨论,5.1、标准对照样品HPLC谱图,5.2、空白对照样品(M)HPLC谱图,5.3、样(A)HPLC谱图对照,硼酸能明显刺激菌体的次级代谢，图谱显示17个主要物质峰，其中6个已知物，与空白对照多出3个峰，其中有1个化合物（未知4）为硼酸培养下特有。,空白,硼酸,5.4、样(D)HPLC谱图对照,Fe3+能明显刺激菌体的次级代谢，图谱中显示16个主要物质峰，其中6个已知物。与空白对照多出2个峰。,Fe,空白,5.5、样(E)HPLC谱图对照,Cu2+能明显抑制化合物(2)、(5)和未知物2、5、6、8、10的代谢，图谱中显示12个主要物质峰，其中4个已知物，但又能同时代谢3种独特的未知化合物（未知3、7、13）。,Cu,空白,（四）两种1403#发酵萃取物HPLC-ESI-MS分析,HPLC-ESI-MS分析 色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱 5m，3.9150mm；流动相为甲醇、乙腈和0.4%冰醋酸水溶液（pH=3.2）三元梯度洗脱，梯地洗脱见表9；柱温为室温；流速1.0mL/min；检测波长254nm；进样量15L。,标准对照样品,结果与讨论,标准对照样品的LC-MS分析,色谱图保留时间为31.94、33.24、34.96min（图7）所得峰形尖锐清晰，但在NI-ESI、PI-ESI中均没有找到对应质荷峰。作者对照前面实验所得HPLC图谱（图3、5）各峰相对位置及强度，推测这3个峰分别为化合物(6)(11)(1)。研究该3种化合物结构，猜测可能是它们均含有多个甲氧基-OCH3和甲基-CH3，而没有相应活泼H存在，使电离困难所致。,参照化合物,硼酸培养条件下发酵液萃取物（样A）HPLC-MS分析,参照化合物中共有10个化合物能通过LC-MS进行分离并实时鉴定，其中灰黄霉素类物质(1)(6)由于MS难以电离，只能通过标样色谱对照进行鉴别。 实验还同时检测出10个未知化合物。 未知物4在液相色谱图中有一个小尖峰，保留时间为28.71min，但在MS中未见相应清晰的分子质荷峰。 未知物6、7的分子质荷峰为偶数峰，作者估计该化合物含有奇数个N原子。,未知物5、9根据MS质谱图观察，推测为含Cl化合物。 未知物1、2、3、8、10质谱数据没有揭示具体结构细节，有待进一步研究。,含N化合物,含N化合物,含Cl化合物,含双Cl化合物,Cu2+培养条件下发酵液萃取物（样E）的HPLC-MS分析,参照化合物中共有9个化合物能通过LC-MS进行分离并实时鉴定。 Cu2+能刺激化合物(8)的代谢，这有别于硼酸条件所得次级代谢物（样A）。 实验检测出14个未知化合物，其中未知物6、12、13含N、未知物 4、7、8、9、10含Cl。 未知物3在液相色谱图中有一个明显尖峰，保留时间为28.77min，但在MS中未见相应清晰的分子质荷峰，物质与样A相同。 未知物1、2、5、11、14质谱数据没有揭示具体结构细节，有待进一步研究。,含N化合物,含Cl化合物,含双Cl化合物,结论,实现预期计划与思路。 硼酸、Cu2+对真菌1403#次级代谢影响显著，是优化培养重要因素。 找到一个适合1403#主要代谢物分离与鉴定的流动相体系。