生物学2013年细胞工程讲解课件

1,第一节 细胞工程概述,（一）细胞工程的定义 （二）细胞工程分类和研究对象 （三）细胞工程理论与技术基础,2,（一）细胞工程的定义,细胞工程 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论和方法，按照人们的需要和设计，在细胞、亚细胞或组织水平上进行遗传操作，获得重组细胞、组织、器官或生物个体，从而能够改良生物的结构和功能，或创造新的生物物种，或加速繁育动植物个体，或获得某些有用产品的综合性生物工程。（P61）,3,细胞工程,应用的原理和方法,细胞生物学和分子生物学等,细胞整体水平或细胞器水平或组织水平,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品,概念,分类,植物细胞工程,研究的目的,研究的水平,动物细胞工程,微生物细胞工程,4,前者是细胞水平或细胞器水平上生物技术, 后者是分子水平上的生物技术。,克隆多莉羊技术是 水平上的技术， 培育抗虫棉是 水平上的技术。,细胞工程与基因工程相比：,细胞,分子,思考:,5,（二）细胞工程分类和研究对象,A、根据研究对象划分 动物细胞工程 植物细胞工程 微生物细胞工程,6,B、根据研究水平来划分： 组织水平 细胞水平 细胞器水平 基因水平,7,C、根据实验操作对象可分为： 细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植 染色体操作 转基因生物等,8,（三）理论与技术基础,1、 理论基础细胞生物学 认识： 原核细胞与真核细胞 动物细胞与植物细胞,9,2、实验室设施与条件 2.1 实验室设置 无菌操作区 细胞制备与观察区 清洗、消毒、灭菌区 储藏区,10,2.2 实验室常用的仪器与设备 超净工作台 显微镜 细胞计数器 离心机 移液器 天平 干燥箱 冰箱 培养箱 显微操作仪 细胞融合仪 冷冻储存器 灭菌系统,p64,11,陈列于操作室（接种室）中 类型：垂直式和水平式 作用：无菌操作用,12,超低温培养箱(-80),13,14,15,16,17,18,19,20,21,3、细胞的主要培养技术,1）、无菌操作技术 2）、细胞培养技术：指生物细胞和组织在体外无菌条件下和适当的温度、气体和营养环境中的保存、生长和增殖。是细胞工程的最基本技术。 3）、细胞融合技术：是指在离体条件下，用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合为一个杂合细胞的技术。包括病毒融合、化学融合和电融合 4）、细胞核移植技术：利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂种细胞。,教材：P65,22,设备：灭菌锅 类型：普通医用消毒锅 大的高压灭菌锅 作用：培养基、水和各种器皿的消毒,高温高压灭菌,23,第二节 动物细胞工程,本节主要内容 动物细胞工程概论 动物细胞培养 动物克隆技术 转基因动物 动物细胞融合及单克隆抗体 干细胞和组织工程,24,1 动物细胞工程(animal cell engineering) 对动物的细胞、组织或器官进行培养、细胞融合、细胞重组、遗传物质转移和生殖工程等，从细胞水平改变动物细胞的遗传特性，用于生产特定生物制品、培育动物新品种。 动物细胞培养和反应器、细胞融合和单克隆抗体、干细胞和组织工程,一、动物细胞工程概论,25,1907：组织培养的鼻祖蛙胚神经培养（R. Harrison） 1940：首次进行了单个细胞的克隆培养（W. Earle） 1965：首次用灭活的仙台病毒实现种间杂交（Okada） 1972：脐带血干细胞治疗白血病 1976：建立杂交瘤培养（Kohler和Milstein） 1986：Demo Biotech用杂交瘤细胞生产单抗 1997：克隆羊Dolly诞生（Roslin研究所） 1998：建立人胚胎干细胞系（Thomson）,2 动物细胞工程的发展,26,动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆抗体 胚胎移植 核移植,27,在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子使离体动物细胞（或组织）生长繁殖的方法。 应用 毒理学研究，组织工程，细胞衰老的研究，神经细胞保护的研究,二、动物细胞培养,28,1、 动物细胞特点,无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感 聚集体形成 原代细胞培养50代即开始退化,29,2.过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,10代细胞,传代培养,无限传代,遗传物质未改变,遗传物质改变,接触抑制,剪碎,30,3 动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,（1）液体培养基,（2）含有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,31,4 动物细胞培养方法,动物细胞的离体培养方法有两种方式： 1）贴壁培养： 对象：大多数原代细胞 2）悬浮培养： 对象：极少数原代细胞适合悬浮培养，仅有造血细胞系、啮齿类的腹水和小细胞肺癌。 3）贴壁-悬浮培养：,32,三、动物克隆技术,1、标志性事件克隆动物 1997年2月27日，英国胚胎学家 Ian Wilmutt等 报道了体细胞克隆羊“Dolly” 诞生,这一研究翻开了体细胞克隆动物的新篇章,33,克隆动物,1997年2月27日 英国胚胎学家Ian Wilmut等科学家nature杂志报道了体细胞克隆羊 “Dolly” 的诞生让全世界大为震惊，有人为之欢呼，有人为之恐慌。 1997年3月11日 世界卫生组织（WHO）宣布： 禁止人体克隆试验。 欧盟委员会宣布： 反对人体克隆试验。 中国卫生部宣布： 禁止人体克隆试验。,34,一条科学成就的宣布，在全世界范围内，在短短几十天左右时间，从学术界到经济界、政界引起巨大而深刻的反响，是空前的。 “克隆”一词也顿时变得妇孺皆知。,35,奥勒冈州沃尔小组：成功克隆两只 恒河猴（1996. 8） 台湾地区吴明杰小组：5只 克隆猪（ 1997. 3. 5 ）,36,日本获得克隆牛,37,我国首例和第二例健康成活的体细胞克隆牛“康康”和“双双”先后于2001年11月3日、6日降生,38,细胞核移植,多莉羊的培育过程,39,DOLLY诞生的意义,(1)证明已经分化的细胞核具有全能性，细胞质对胚胎分化的决定性。 (发育生物学、遗传学影响，动物资源保存、育种、与转基因技术结合) (2)哺乳动物具有无性繁殖的可能性 （冲击家庭、社会伦理道德、法规）. (3) 按人类意志改造物种。,40,（4）治疗性克隆作为人体器官移植的代用品。 （5）人类疾病的动物模型。 （6）珍稀濒危动物资源保护。 （7）动物育种。,41,2、动物克隆技术的应用,解决某些妊娠时间长、每胎产子数量少的优良种畜的繁殖速度问题。,42,3、动物克隆常用的技术,动物克隆技术,细胞核移植技术,卵裂球培养,胚胎分割技术,胚胎细胞核移植技术 干细胞核移植技术 体细胞核移植技术,43,重组细胞,体细胞细胞核,早期胚胎,受精卵,去核卵细胞,克隆动物,试管婴儿,核移植,胚胎移植,体外受精,克隆动物的技术路线,44,1) 存活率低， 可能出现老化 2) 缺乏基础理论支撑 3) 动物克隆种属及细胞差异的原因 4) 条件优化没有解决,4、动物克隆技术存在的问题,教材：P68,45,四、转基因动物,1、定义： 转基因动物：是人类按照自己的意愿，借助基因工程技术将外源基因导入受体动物细胞染色体内，有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，使得外源基因与受体细胞整合、在体内稳定表达并能稳定遗传给后代的动物。,教材：P68,46,【羊城晚报】报道,英国一电视台在一节目中披露一：绵羊长着人心脏、山羊会吐蜘蛛丝、奶牛尺寸是普通牛的3倍大，而猪则会在黑暗中发光！ 据报道，英国第四频道将在一个富有争议的电视秀中揭开一个转基因动物农场中的惊人内幕，这个电视秀将披露许多通过转基因技术、克隆技术和细胞更改技术饲养出来的古怪动物。其中包括长着人类心脏的绵羊、会吐蜘蛛丝的山羊、在夜晚身体会发光的猪、以及尺寸是普通奶牛三倍大的“施瓦辛格”奶牛。研究转基因动物的科学家们甚至还通过高科技技术，单独培育出了一个人的鼻子组织。 据悉，这一电视秀系列将由英国电视记者和生物学家奥利维娅朱德恩主持，朱德恩是转基因实验的支持者，她和许多科学家都相信转基因食品将是解决全球饥饿问题的万能药，和战胜人类疾病的关键武器。,47,转基因小鼠,48,49,2012.3.9 扬城晚报报道： 6年后“转基因猪”可移植器官给人 南京医科大学的“转基因敲除猪”,50,2、转基因动物构建方法,外源目的基因的制备 外源基因导入动物细胞（核心技术） 获得含有外源基因的细胞，选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因动物胚胎发育及鉴定 筛选转基因动物品系,51,常用的方法：,1）显微注射法：利用显微操作技术系统和显微注射技术将外源基因直接注入实验动物的受精卵原核，使外源基因整合到动物基因组，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。,52,显微操作系统,53,54,2) 胚胎干细胞移植法： 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。 特点： 分化潜能和整倍体核型,55,人多能胚胎干细胞,胎儿,囊胚,全能性细胞,内部细胞团,原始生殖细胞,全能性干细胞系,56,从ES细胞获得转基因动物,57,58,3）逆转录病毒感染法：用逆转录病毒作为载体去感染受精卵（不适合显微操作)，反转录病毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞的死亡，被它感染或转化的动物细胞常可持续许多世代。,59,逆转录病毒法,60,4）精子载体导入法：将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带的外源DNA进入卵中并受精，从而使外源DNA整合到染色体中。再利用人工受精过程产生转基因动物,61,5）体细胞移植法：以动物细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等）为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆。,62,3.转基因动物的应用,利用动物产生有益蛋白：如利用转基因技术，让羊乳汁分泌人凝血因子、让牛分泌人乳铁蛋白和让猪分泌人血红蛋白。 利用转基因动物研究遗传病治疗。可以利用这项技术培育缺陷性状矫正动物新品系，在动物身上做实验，可以为这种病治疗提供经验和动物模型。 转基因动物可能为因患病而导致某个器官功能衰退的病人提供健康的器官。如：“具有人类心脏的猪” 培育更优良性状的转基因动物。例如，通过将牛的生长激素基因导入到猪身上，就能获得吃的少，生长快，瘦肉多但个头大的转基因猪。 培育抗病能力强的禽畜新品种。,63,4、 存在问题,（） 转基因动物低效性： （） 转入基因造成宿主基因突变 （） 转入基因表达障碍 （） 病毒载体基因脱落、产生毒粒 （） 动物模型与预期不符 （） 乳腺生物反应器 （） 安全性与社会问题,64,五、动物细胞融合及 单克隆抗体制备,65,（一） 细胞融合 1、定义：两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象 类型： 同源融合细胞：基因型相同的细胞形成的融合细胞。 异源融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞。,66,2.细胞融合过程：,诱 导,细胞膜穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞,67,细胞融合,68,物理法：,化学法：,生物法：,灭活的病毒,仙台病毒,丧失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,（诱导细胞融合）,3、诱导的过程：,电场、激光,毒性低、融合率高、可控定向融合、费用高,PEG、聚甘油、磷脂酰胆碱等,随机、不受控,随机、不受控、融合率低,69,4、原理,细胞膜的流动性,5、用途： 制备单克隆抗体,动物细胞融合相当于植物体细胞杂交的原生质体融合过程,70,（二） 单克隆抗体,单: 单个细胞 克隆: 无性繁殖 抗体: 化学性质单一、特异性强,71,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴结,B 细胞,72,传统抗血清的交叉反应,专一性反应,沒有反应,交叉反应,+,-,?,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1 2 0 Ag A,73, 一个 B 细胞只能生产一种抗体，对付某一 抗原决定基。, 若有许多抗原决定基，则需许多株 B 细胞分別生产许多抗体。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,抗 原,B,Y,B,成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,74,原始的方法获得抗体，特异性差，纯度低。 想获得单一抗体，必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，通过克隆形成细胞群。,1、单克隆抗体的产生,75,体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增值的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？,怎么办？,问题1,76,设计方案： 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,杂种细胞,根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒 设计的 实验方案:,细胞融合,77,如何正确筛选出B细胞与小鼠瘤细胞的融合细胞？,问题2,78,2、杂交瘤的筛选 HAT筛选,HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,79,m,核酸补救合成,m,核酸从头合成,核酸,氨甲喋呤(A),次黄嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPRT-,HAT筛选原理,胸腺嘧啶核苷激酶,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶,80,HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻,81,抗原免疫的脾细胞（B 细胞）,小鼠骨髓瘤细胞 （恶性肿瘤细胞）,抗体分泌 HGPRT,具永生性 HGPRT,PEG融合,HAT筛选,脾-骨髓瘤细胞 （杂交瘤细胞）,（HGPRT+、Ig+）,82,3 杂交瘤技术过程,83,？,？,抗原,效应 B细胞,筛选,筛选,杂交瘤细胞,单克隆抗体制备示意图,84,抗体,-a,-b,-c,-d,-a -b -c -d,BALB/c,a,b,b,c,d,传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和,脾脏产生各种 B 細胞,免疫前要先 把抗原作 成乳剂,免疫,抗原,采血后可得传统抗血清,已建立之小鼠 骨髓癌细胞株,由脾脏收集 B 细胞,抗原通常有多个抗原決定基,免疫后 的脾脏,约在两月內 注射五到八次,Ag X,85,细胞融合,Ag X,Ag X,ELISA,HAT,PEG Cell fusion,Hybridoma cells 融合瘤细胞,(确定只有一种细胞),d,d,a b c d,a b c d,+ + + +,+ + + -,X,-d,-c,-b,-a,+,-,-d,分株培养筛选,筛选,单抗,传统抗体 (抗血清),试验专一性,对 抗 原 的 反 应,无 法 分 辨,完 全 不 同,86,制备单克隆抗体的基本技术,抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 抗体检测 杂交瘤的克隆化和冻存 McAB的制备 单克隆抗体的纯化,87,单克隆抗体的特性,理化性状高度均一； 生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应； 特异性强； 纯度高； 易于实验标准化和大量制备。,88,4：人源性单抗的制备,为什么要制备人源性单抗？ 鼠源性单抗带有鼠抗原决定簇，应用具有局限性,89,EBV转化-融合技术 嵌合抗体技术 改型抗体技术 噬菌体抗体库技术,人源性单抗的制备方法,90,EBV转化-融合技术,91,92,方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,嵌合抗体,93,嵌合抗体,94,定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体 意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗,改型抗体,95,改型抗体技术,鼠源性基因 人源性基因,96,定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性,噬菌体抗体库技术,97,用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。 抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人,（一）基本原理和程序,98,噬菌体抗体库,99,从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； 表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。,构建噬菌体抗体库,100,101,102,模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性,（二）噬菌体抗体库技术的特点,103,避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体,104,5 、单克隆抗体的应用：,在基础理论研究中具有重要意义,在疾病诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，具有产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显,作为载体，运载抗癌药物，制成生物导弹,105,六、干细胞和组织工程,（一）干细胞 一类具有自我更新和分化潜能的细胞,干细胞,全能干细胞,多能干细胞,单能干细胞,个体,多种细胞、组织,定向分化,106,干细胞,胚胎干细胞,成体干细胞,107,1. 胚胎干细胞 应用： 动物克隆与人类治疗性克隆 转基因动物 制备嵌合体动物,高度未分化的多能干细胞,108,109,2. 成体干细胞,110,111,成体干细胞种类,造血干细胞 间充质干细胞 精原干细胞 神经干细胞 表皮干细胞 肠干细胞 肝干细胞,112,113,114,115,116,117,118,2、 组织工程,119,120,121,修复缺损器官的方法 自体移植 异体移植 组织代用品,122,基本概念,组织工程（Tissue engineering） 应用工程学和生命科学，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工替代物的一门学科,123,组织工程 通俗的讲，这种方法不是“挖肉补疮”的式的修复，也不是“移花接木”式的手术，而是利用人体自身细胞和组织工程的理论与方法，使原先缺损的组织和器官沿着设计好的支架、模型顺其自然地成长起来。,124,组织工程的基本要素：,种子细胞（Cell） -增殖、分化、自组装成组织和器官,生长因子（growth factor） -调节细胞的增殖和分化,胞外基质（Extracellular matrix, ECM) -支撑和指导细胞增殖、分化,125,生长因子,细胞,生物材料,体外长成腿即器官再进行移植,126,127,128,129,第三节 植物细胞工程,130,植物细胞工程（Plant Cell Engineering）： 指以植物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特征按人们的意愿生产某种物种的过程。,131,本节内容提要,植物细胞与植物组织培养 植物组织培养的基本方法 组织培养与应用 植物细胞培养与次生代谢细胞工程 转基因植物,132,一、植物细胞与植物组织培养,1、植物组织培养的发展简史 植物组织培养的研究始于1902年德国植物学家Haberlandt，至今已有100多年的历史，学科基础是Schwann&Schleiden创立的细胞学说，大致经历三个阶段,133,探索阶段（1902-1929年）,Haberlandt：,观点：,贡献：,提出细胞全能性,小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞,无分裂,细胞高度分化+培养基中无生长激素,首次进行离体细胞培养,高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞,Knop+蔗糖,134,奠基阶段,贡献：建立了植物组织培养的综合培养基；扩大了培养对象；建立植物组织培养的基本方法,135,迅速发展阶段 上世纪60年代后，植物组织培养进入迅速发展期。 1960， Cocking用真菌纤维素酶由番茄幼根分离获得有活力的原生质体 1962， Murashige 和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基，即目前使用最多的MS培养基 1964， Guha和Maheshwari从曼陀罗花药培养获得单倍体植株 1970， Carlson通过离体细胞筛选获得体细胞突变体 1971， Takebe首次由原生质体获得再生植株 1972， Carlson通过原生质体融合获得体细胞杂种 1978， Melchers等获得番茄与马铃薯体细胞杂种；同年，Murashige提出人工种子的概念 80年代后，遗传转化技术建立并逐步成熟，通过细胞工程手段获得改良植物逐步形成品种，在生产上发挥作用,贡献： 完善了培养基的营养成分；建立了各种培养技术，扩大了培养材料,136,概念： 植物的离体器官、组织或细胞在人工控制的环境下培养发育成完整再生植株的技术。,植物组织培养,植株培养 胚胎培养 器官培养 组织培养 细胞培养 原生质体培养,2、植物组织培养的概念与分类,137,细胞分化与脱分化,细胞分化，是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。 它包括： 时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能； 空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。,138,脱分化：植株上已经分化的细胞或组织离体后在培养条件下逐渐恢复到分生状态的过程。 已经脱分化的细胞或组织在一定条件下，它们又可以经过胚状体或愈伤组织再分化出芽和根，从而发育成一个完整的植株,139,3、植物细胞组织培养的理论基础,植物细胞工程的理论基础是： 植物细胞的全能性,概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。 原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。,140,动物和植物细胞都可在一定的条件表现出全能性，其中最先发现的是植物细胞的全能性，植物细胞表现全能性要求的条件更容易达到。 但不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。,植物细胞全能性的差异 根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生 组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织。,141,生物体内的细胞为什么没有表现出全能性，而是分化成不同的组织器官？ 基因在特定时间和空间条件下选择性表达的结果 在什么条件下植物细胞表现出全能性？ 处于离体状态，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下 克隆羊”多莉“的诞生说明了什么？,142,二 植物组织培养的基本方法,1、试验材料的准备和清洗、消毒等 准备试验材料，即一般为植物器官的外植体 清除材料内部的微生物 不能损害试验材料 2、准备培养基,培养基是指人工配制的含有营养物质供培养物生长分化的介质。通常含无机营养物质(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、生长调节剂(2，4-D或NAA、KT或6-BA)以及有机附加物(维生素、甘氨酸)等几类物质组成。,P8485,143,3、接种与培养 在无菌条件下操作，把材料放进培养基 4、愈伤组织的培养和诱导,愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成。在离体培养条件下，外植体中的活细胞经诱导脱分化，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织,144,自然条件下：通过内源生长因子、特别是植物生长素的释放，也能激发细胞分裂产生愈伤组织 人工条件下：在生长素（高浓度）和细胞分裂素（低浓度）作用下，外植体经诱导生成愈伤组织。 愈伤组织类型： 结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽 结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立,145,5、诱导产生器官或体细胞胚 器官产生：愈伤组织形成细胞团器官原基形成器官（先芽后根） 体细胞胚：具有两极性，可一次性再生完整植株。 6 、小苗移栽,146,147,三、植物细胞培养与应用,花药花粉培养单倍体育种 离体胚培养杂种植株获得 原生质体培养体细胞融合,148,植物体细胞杂交,植物细胞A,植物细胞B,去细胞壁,原生质体融合,杂种细胞,植物细胞融合,1、植物体细胞杂交的结果 是产生了？ 2、这个过程中涉及的原理是？,杂种植株,细胞膜的流动性 植物细胞的全能性,149,植物体细胞杂交,植物体细胞杂交是用两个来自于不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。（因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的）,杂合的原生质体,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,150,植物体细胞杂交,原生质体制备（酶解法去细胞壁） 原生质体融合（人工诱导） 杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织） 杂种植株的再生与鉴定,物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇等试剂,纤维素酶、果胶酶等,151,四、植物细胞培养与次级代谢产物工程,植物细胞培养： 指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过传代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。,152,1 ）愈伤组织的诱导和培养 2） 从愈伤组织到细胞株 调节培养基营养成分组成，愈伤组织在传代培养若干代后，产生细胞群，该细胞群能适应进一步的的悬浮培养，从而建立稳定的悬浮培养植物细胞系,植物细胞培养过程,153,植物细胞培养的应用： 生产有用的代谢产物,1、 利用植物细胞培养进行药物生产 太平洋紫杉细胞生产抗癌药物紫杉醇、 人参细胞培养人参皂苷和人参多糖、毛地黄细胞培养转化毛地黄毒苷 典型案例：紫杉醇生产,154,案例,紫杉醇(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。 1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉，Taxus. brevifolia）树皮中提取出来。该药于1990年进入期临床试验， 1992年底获美国FDA批准上市。,155,紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g,156,日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。 Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。 清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在23天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。,157,2、利用植物细胞培养生产天然色素 典型案例紫草宁,158,紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用。 紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部 。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（Arnebia euchroma)列入了国际二级保护植物,159,紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。 化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且最终产率只有0.7，生产成本昂贵。 紫草宁在国际市场上售价高达7000美元/kg,160,1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。 1981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获 得了紫草宁衍生物。 日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。 我 国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究，在进行大量的研究之后得出， 在适当的条件下，培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中 的含量高10倍。,161,五、转基因植物,（一）转基因生物的概念 （二）转基因植物的构建方法 （三）转基因植物的筛选 （四）转基因植物的应用,162,（一）转基因生物的概念,转基因生物：将一种生物的基因导入另一种生物, 定向改造生物, 使之向着有利于人类需要的方向发展。 世界第一例转基因植物烟草1983年在美国问世。 1986年,首批转基因植物抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。 1992年中国成为世界上第一个转基因植物商品化种植的国家，开创了转基因植物商品化应用的先河；当时种植的是一种抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒双价转基因烟草。,163,（二）转基因植物构建方法,1 农杆菌导入法 有一种土壤细菌,称为农杆菌(Agrobacterium tumefaciens),它能诱导植物伤口形成冠瘿瘤,细菌的致瘤能力来源于Ti 质粒 发根农杆菌,诱发寄主植物产生毛根，含有Ri 质粒 Ti 和 Ri 质粒通过它们可以将外源的 DNA 转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物,164,165,Ti 质粒的结构 各种不同类型的 Ti 质粒都具有 T-DNA 区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点。其中以 T-DNA 区和毒性区在植物转化中最为重要。,166,（1）T-DNA 区（transferred-DNA regions） T-DNA 是农杆菌侵染植物细胞时，从 Ti 质粒上导入植物细胞的一段DNA，故称之为转移 DNA。 T-DNA 有左右两个边界 ，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 致瘤基因,167,（2）Vir 区 Vir 区段上的基因与 T-DNA 从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。Vir 区段总长度大约 35kb，由 7 个互补群组成，分别命名为 VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG 和 VirH。,毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种： 组成性表达（ VirA ） 植物诱导性表达（ VirB、VirC、VirD 和 VirE ）,168,Vir 区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。 Vir区对T-DNA 的作用既可以以顺式作用方式进行，也可以以反式作用方式进行。（这个特性对植物遗传转化非常重要）,169,（3）Con 区 Con 区(regions encoding conjugations):该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控 Ti 质粒在 农杆菌之间的转移。 （4）Ori 区(origin of replication) 该区段基因调控 Ti 质粒的自我复制，故称之为复制起始区。,170,2）根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理 6个步骤： （1）农杆菌受受体的影响 （2）农杆菌附着到植物受体细胞 （3）诱导启动毒性区基因表达 （4）类似接合孔复合体的合成和装配 （5）T-DNA的加工和转运 （6）T-DNA的整合,171,172,3）转化过程,173,2、 基因枪介导法 基因枪法，又称生物弹法、微粒轰击法，是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。基因枪法是继农杆菌介导法之后又一应用较广的遗传转化技术,174,转化原理 这种方法是在微粒子表面衣裹DNA，然后用粒子加速器将粒子加速，高速粒子可以穿入各种组织或细胞，从而完成DNA的输送。,175,176,3 原生质体介导法,概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源直接导入植物细胞的方法。 主要方法: 1) PEG介导的基因转化 2) 脂质体（liposome)介导的基因转化 3) 电激法 4) 激光导入法 5) 显微注射法,177,(1)PEG转化法 原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子， 进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。 案例： PEG法最早用于水稻遗传转化并获得转基因水稻植株。原理是将水稻原生质体悬于含质粒DNA的PEG中，由于渗透压的作用，质粒DNA透过原生质体膜进入细胞内，随机地整合到水稻的基因组中，经原生质体再生成完整植株。,178,（2） 脂质体介导基因转化,原理：利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体,通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。 特点：转化率高; 操作繁琐; 技术性高。,179,（3） 电激法 原理： 是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔“、细胞膜上会出现短暂可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，借此可以导入外源DNA。特别是在禾谷类作物中有发展潜力。,180,（4） 超声波转化法 现在超声波击穿细胞的机制还不是很清楚，但一般认为有以下两种可能性： 第一，超声波引发的空气泡破裂时产生的高压与高温冲击波可能导致局部细胞质膜的破裂，在细胞质膜复原以前，就有可能吸收周围物质如DNA分子等，从而发生转化现象； 第二，Zimmermann等的电场机制模型