骨和软骨再生课件

骨再生,神经再生重点实验室 张琦 2010.05,主要内容,骨的基本结构和功能 生长因子与骨再生 细胞工程骨的种子细胞 细胞工程骨的支架材料 组织工程骨的临床应用,第一节 骨的基本结构和功能,骨的基本结构包括骨膜、骨质和骨髓。,功能：支持、保护、造血、贮钙,一、骨的基本结构,（一）骨膜,Sharpey纤维（穿通纤维）,骨外膜（periosteum）,骨内膜（endosteum）,纤维层,生发层,血管未分化区,（二）骨质,骨密质（compact bone）,骨松质（spongy bone）,环状骨板 （circumferential lamellae） 骨单位 （osteon，又称哈弗系统， Haversian system） 间骨板 (interstitial lamellae),外环骨板:10-40层,内环骨板:数层,不规则的平行骨板（骨单位被吸收后的残留结构）,哈弗斯骨板:10-20层同心圆排列的骨板,哈弗斯骨管 (中央管）,长骨骨干结构模式图,（三）骨髓,骨髓充填于骨髓腔和松质间隙内。 胎儿和幼儿的骨髓内含发育阶段不同的红细胞和某些白细胞，称红骨髓，有造血功能。 5岁以后，长骨骨干内的红骨髓逐渐被脂肪组织代替，呈黄色，称黄骨髓，失去造血活力。 但在慢性失血过多或重度贫血时，黄骨髓可转化为红骨髓，恢复造血功能。而在椎骨、髂骨、肋骨、胸骨及肱骨和股骨的近侧端松质骨内，终生都是红骨髓，因此，临床常选髂后上棘等处进行骨髓穿刺，检查骨髓象。,二、骨组织的组成,细胞,细胞外基质 （骨基质）,骨祖细胞（osteoprogenitor cells）,成骨细胞（osteoblast）,骨细胞（osteocyte）,破骨细胞（osteoclast）,无机成分：骨盐，羟基磷灰石结晶,有机成分 ：胶原纤维、无定形基质,骨组织的各种细胞和骨板,三、骨的发生,（一）膜内成骨 (intramembranous ossification) （二）软骨内成骨 (endochondral ossification),骨祖细胞,骨细胞,间充质细胞,骨基质,骨组织,成骨细胞,纤维和基质（类骨质）,分泌,钙化,骨组织形成的基本过程,骨组织的吸收,转化为,骨组织的形成和吸收同时存在，处于动态平衡。,（一）膜内成骨,骨化中心,骨组织,在原始的结缔组织内直接成骨，扁骨和不规则骨以此种方式成骨。,（二）软骨内成骨,在预先形成的软骨雏形的基础上，将软骨逐步替换为骨。见于四肢骨、躯干骨等。,（1）软骨雏形形成,（2）骨领形成,间充质细胞骨祖细胞成软骨细胞软骨细胞,周围的间充质分化为软骨膜,软骨膜内的骨祖细胞分化为成骨细胞，成骨细胞形成骨细胞。,（3）初级骨化中心与骨髓腔形成,最早出现过渡型骨小梁的部位即初级骨化中心,过渡型骨小梁被破骨细胞分解吸收，融合成骨髓腔,（4）次级骨化中心与骨骺形成,次级骨化中心出现在骨干两端的软骨中央，出现时间多在出生后数月或数年。成骨过程与初级骨化中心相似，但骨化是从中央向四周进行的。最终形成骨骺。,骺板,过渡型骨小梁,初级骨髓腔,四、骨的生长、改建与修复,加长,软骨储备区软骨增生区软骨钙化区 成骨区,增粗,一般1720岁终止,一般30岁终止,五、影响骨生长发育的因素,（一）激素对骨生长发育的影响 （二）骨生长因子对骨生长发育和愈合改建的影响 （三）维生素对骨生长发育的影响 （四）物理因素对骨生长发育的影响,第二节 生长因子与骨再生,根据国内外骨缺损修复生物学研究表明，影响骨再生的因素主要包括以下四个方面： 有分化增殖能力的原始细胞； 调控骨发生的多种生物活性物质，主要包括细胞因子及其受体； 适合细胞生长并利于恢复原有的骨形态及骨连续性的微环境和框架结构； 机体本身所提供的血供和营养成份。,促进骨再生的机制主要有三种： 骨发生：指移植物携带的细胞能在移植骨区形成新骨； 诱导成骨：指移植物的生物活性物质能诱导宿主间充质细胞聚集并分化为成骨细胞形成新骨； 传导成骨：指移植物能提供支架结构引导血管和成骨细胞长入移植骨形成新骨。,一、骨生长因子及其生物学特性,骨形态发生蛋白（BMPs） 转化生长因子（TGF-） 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 胰岛素样生长因子（IGF） 血小板衍生生长因子（PDGF） 血管内皮细胞生长因子（VEGF） 肿瘤坏死因子（TNF） 白细胞介素-1（IL-1）,1963年是美国的Marshall R.Urist教授发现了BMP。 发现：把脱钙的皮质骨植入动物的肌肉中，1-2周后会有新骨形成。 结论：植入的骨虽是死的，但其中可能含有某种物质在诱导新骨的形成。 从皮质骨中提取获得了对成骨至关重要的“骨形态发生蛋白”，在全世界范围内掀起了成骨诱导研究的热潮。,近年来基因重组的BMP- 2和BMP-7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组BMP-2用于脊柱融合。 功能：可明显增加型胶原、ALP、骨钙蛋白、骨桥蛋白、血管内皮细胞生长因子及血小板衍生生长因子mRNA的表达，增强刺激成骨细胞分化、骨基质蛋白形成和矿化作用、血管发生和软骨形成的能力，从而提高其骨诱导性。也可诱导肌源性细胞向骨及软骨细胞分化。,转化生长因子（TGF-）,在骨组织中，TGF-1的含量最为丰富，其对骨再生的作用表现为： 对骨基质的形成和吸收有多效性，是骨形成与吸收的双重因子； 促进骨膜下间质细胞增殖分化为成骨细胞和成软骨细胞，成骨细胞合成大量胶原，最终导致新骨形成； 诱导人胚成骨细胞合成胶原蛋白，增加骨形成过程中胶原蛋白的含量，从而加速新骨基质的形成及新骨的沉积； 刺激成骨细胞不断增殖并由不成熟型向成熟型转化。,二、生长因子的作用机制,ras通路 JAKs-STATs途径,三、生长因子的协同作用,PDGF与IGF的协同作用 VEGF与BMP的协同作用 BMP与TGF-的协同作用 时间-效应错位 BMP与FGF的协同作用 富血小板血浆,第三节 细胞工程骨的种子细胞,成骨细胞是组织工程骨的关键细胞。 成骨细胞的组织来源主要有骨髓、骨膜及颅顶骨、髂骨等松质骨。随着细胞培养技术的提高，现已可从各种动物及人的胚胎、幼年及成年个体中培养出相应的成骨细胞。 成骨细胞主要功能是合成、分泌骨基质并促进基质矿化形成骨组织。 在体内环境中，成骨细胞位于细胞外基质（ECM）中，与骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞等有广泛联系。,成骨细胞分泌的基质从形态上可分为定形成分和无定形成分。 定形成分：型胶原，是钙盐沉着和细胞附着的支架。 无定形成分：骨结合素（ON）、骨钙素（OC）、骨桥蛋白（OPN）、纤连蛋白及一系列生长因子。 成骨细胞还能释放钙离子和ALP等酶类物质。 体外培养的成骨细胞表现为增殖态和功能态两种相对状态。按顺序进入增殖期、胞外基质合成期及钙化期。 型胶原从增殖期开始表达，基质合成期达高峰； ALP是成骨细胞分化的早期标志物，基质合成期开始出现，钙化期达高峰； OC是成骨细胞分化成熟的标志，一般钙化早期开始表达，钙结节成熟后达高峰。 一般常将型胶原、ALP、OC作为成骨细胞的鉴定指标和功能状态的评价指标。,培养的鼠成骨细胞,人脐带间质干细胞分化为成骨细胞,茜素红染色检测钙结节,钙缺乏的羟基磷灰石 (CDHA),CDHA +异体MSC,CDHA + 自体 MSC,兔桡骨远侧15mm缺损修复后16周,未处理,成骨细胞与细胞外基质的关系,整合素（integrin）,墨汁灌注及扫描电镜显示组织工程骨的血管化,成骨细胞与血管内皮细胞的关系,成骨细胞与破骨细胞的关系,组织工程骨进行体内植入时，实现成骨与破骨这对矛盾的正负调控有着重要意义。 在植入早期应该对成骨进行正调控，对破骨进行负调控，期望形成大量新骨。 在后期应该对成骨进行负调控，对破骨进行正调控，使组织工程骨上沉积的新骨不致于过量，同时尽早完成组织工程骨的改建，使其早日发挥生理功能。 通过合理使用生长因子，构建适宜的ECM以及为组织工程骨提供三维力学环境，可实现这种正负调控。,成骨细胞与骨细胞的关系,在体内，成骨细胞产生ECM并实现ECM的钙化，成骨细胞被埋于钙化基质中，成骨细胞最终转化为骨细胞。在一定条件下，骨细胞在自身ECM包埋中可转化为成骨细胞。 两者相比，骨细胞ALP活性低，但甲状旁腺激素刺激的cAMP及OC、OPN、ON的表达强于成骨细胞，骨细胞的机械应力感受能力比成骨细胞强。骨细胞通过细胞膜上整合素与ECM紧密接触感受机械应力，引起胞内信号传递，最终将导致ALP活性及膜上的界沟变化，并通过界沟将信号传递到相邻成骨细胞，引起成骨细胞发生相应变化。,理想的组织工程骨应具有以下特点：,包括无机和有机成分，力学性能类似于自然骨，同时可为成骨细胞提供最佳的胞外基质； 含有成骨细胞、血管内皮细胞等复合细胞成分，植入体内时成骨和血管化能够同步、快速地完成； 通过合理使用生长因子和构建三维力学环境，对成骨和破骨进行正负调控。,第四节 细胞工程骨的支架材料,理想的支架材料应具备以下条件： 良好的生物相容性； 足够的机械强度、良好的骨传导性和可塑性； 适度的生物可降解性，降解速度需和骨再生速度相匹配，降解产物不产生炎症反应和毒性反应； 特定的生物活性和良好的表面相容性，能在分子水平诱导特异性细胞应答； 良好的结构相容性，具有相互连通的孔隙，一定的孔隙率及特定的三维结构，有利于新骨的长入，有利于营养物质的输入和代谢产物的排出。,羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA),复合支架材料,人工合成无机材料,人工合成有机高分子材料,联合多种材料制备复合支架,天然生物衍生材料,同种异体骨材料（天然生物衍生骨材料）的超微结构，与成骨细胞体外复合培养，显示良好的细胞相容性,天然生物衍生材料,第五节 组织工程骨的临床应用,一、组织工程产品临床应用的基本条件 扎实的基础研究 安全性、有效性评价 “医生进行人体生物医学研究指南”,二、组织工程骨的临床应用,目前尚无正式批准的组织工程骨的临床产品。目前组织工程骨的临床实验已有不少单位开展。在已报道的病例中，其临床应用的初步结果令人满意，尚未发现并发症和骨不愈合。但其远期结局尚需要经过更长时间随访，并继续深入研究之后才能判断，因此目前还不能作为常规植骨术用于临床，只能在严格的适应证下，进行有限的临床应用，并必须征得病人的同意，签署知情同意书，获得有关政府部门的批准。,Clinical Application Protocol of Injectable Tissue-Engineered Bone,纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料,纳米仿生骨材料在植入12周后即有大量骨痂形成，骨皮质基本连续，新生骨组织随时间推移逐渐塑性,骨组织工程研究中有待解决的问题,成骨细胞的培养 支架材料的选择 种子细胞和支架材料的组装模式,采用骨组织工程技术来修复骨缺损比其他骨移植（自体骨、异体骨和异种骨移植）相比的优点：,需要的供体组织少（细胞可在体外培养、增殖），供体来源不受限制，供体损伤小； 无抗原性或抗原性甚微； 可根据修复缺损的需要将植入物制成精确的三维形状； 可利用仿生设计技术，设计出与天然骨相似的组织工程骨，为长管状的大段或较大范围的骨缺损的修复提供新的途径； 组织工程骨具有生命力，是一种活骨移植，可缩短骨缺损的修复时间并使骨缺损的修复质量提高。,软骨再生,曹谊林等在国际上首次应用组织工程技术在裸鼠体内再生了人耳廓形态软骨，在国际医学界引起了巨大的轰动，被称为组织工程研究领域中一个新的里程碑，并为此获得了国际整形外科学界最高荣誉奖。,主要内容,软骨的基本结构和功能 关节软骨的生物力学 软骨组织工程 组织工程化关节软骨的临床应用,第一节 软骨的基本结构和功能,软骨组织（cartilage tissue） 由软骨细胞和软骨基质构成 软骨由软骨组织和表面的软骨膜构成，软骨组织内无血管 软骨是胚胎早期的主要支架，随着胎儿发育大部被骨取代，成体内有少量分布 主要功能：分散接触应力，减少摩擦,软骨组织,组 成 软骨细胞 基质 间质 纤维,分 类 根据纤维成分 透明软骨 纤维软骨 弹性软骨,透明软骨(hyaline cartilage),软骨细胞,同源细胞群,软骨囊,1.软骨组织,基质 似疏松CT，以硫酸软骨素含量较高。基质富含水，无血管，营养靠渗透。 纤维 胶原原纤维，无明显的横纹，折光率同基质。 软骨细胞(chondrocyte) 细胞质弱嗜碱性，核椭圆形。细胞位于软骨陷窝内。 周边：细胞较幼稚，体积小，呈扁圆形，单个分布。 中央：细胞接近圆形，成群分布同源细胞群(isogenous group) 。软骨囊。 超微结构：胞质内有丰富的粗面内质网和发达的高尔基复合体。 功能:产生纤维和基质。,2.软骨膜(perichondrium),为致密的CT，含血管、神经。 外层：纤维多，细胞少。 内层：纤维少，细胞多， 含骨祖细胞 软骨细胞。,软骨膜(透明软骨)光镜图 (蓝:外层 绿:内层),3.软骨的生长方式,附加性生长（软骨膜下生长）：软骨膜内骨祖细胞成软骨细胞软骨细胞产生纤维和基质软骨加厚 间质性生长（软骨内生长）：软骨细胞增殖和生长产生新基质软骨由内至外扩大,纤维软骨 (fibrous cartilage),纤维软骨光镜图,弹性软骨 (elastic cartilage),弹性软骨光镜图 醛复红染色 1软骨细胞；2弹性纤维；3软骨膜,第二节 关节软骨的生物力学,一、关节软骨的渗透性和黏弹性 渗透性：当存在压力差时液体通过多孔基质在软骨中运动或流向关节表面，健康关节软骨的渗透性很小，负重时水分受压流出，软骨变形。 黏弹性：软骨的变形与施加外力的速度密切相关。生理状态下的软骨总是处于动态负载中，以保持软骨组织存在的液体压力，是一种动态的平衡。,二、关节软骨的润滑 两种基本润滑类型 界面润滑：滑液中的分子通过化学作用吸附在关节面上形成一个界面层。 液膜润滑：由原来的滑液和挤压出来的软骨组织液组成关节面间的压力液膜，它的内压可以短期内支撑较大的载荷。,三、关节软骨的摩擦 两种磨损 界面磨损：由两个承载面相互作用引起，往往发生在关节缺乏润滑而使承载面直接接触，如退变性骨关节痛。 疲劳磨损：由关节变形引起，多发生于长期应力作用下微损伤的积累，可以是相对较短时间内的高载荷或长期的低载荷作用，可发生于润滑好的关节，如创伤性骨关节炎。,四、关节软骨退变的力学因素 软骨退变的两个原因 软骨本身的缺陷：年龄增加 外力荷载过重、过频繁或反常载荷：足球运动员的膝关节、芭蕾舞演员的踝关节,关节镜下可见软骨的严重磨损,第三节 软骨组织工程,一、软骨组织工程种子细胞 来源丰富，取材方便； 容易培养，有较强的传代增殖能力； 植入受区后能保持所修复组织的表型； 对机体或供区损伤小，无明显免疫排斥或其他潜在危险。,种子细胞的种类,软骨细胞（自体软骨细胞移植：提取健康软骨细胞，培养，植入缺损处） 骨膜或软骨膜细胞 骨髓来源基质干细胞 肌肉来源干细胞 脂肪来源干细胞 脐带来源的干细胞 基因修饰的组织工程软骨种子细胞,培养的犬软骨细胞,培养的人MSC,MSC向软骨细胞分化,种子细胞在微载体生物反应器系统的培养,Cytodex,微载体是指直径在60-250m，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。,图1 软骨细胞进旋转细胞培养系统（RCCS）前甩片，蕃红花“O”染色呈阳性 100 图2 软骨细胞进RCCS前甩片， II型胶原染色呈阳性 100 图3 RCCS培养第12 天的软骨细胞甩片，见软骨细胞聚集生长，蕃红花“O”染色呈强阳性 100 图4 RCCS培养第12 天的软骨细胞甩片，见软骨细胞聚集生长，II胶原染色呈强阳性 100,二、软骨组织工程支架,软骨组织工程支架材料的要求： 良好的生物相容性 良好的生物降解性 良好的结构相容性 可塑性和一定的机械强度 良好的表面活性,明胶/硫酸软骨素/透明质烷三聚物支架的电镜照片。显示了支架的多孔结构，孔径约为180m，孔隙率为75%。,PGA 支架种植人软骨细胞后 2周,三、软骨组织工程生物调控因子,转化生长因子（TGF） 碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF ） 肝细胞生长因子（ HGF ） 胰岛素样生长因子（ IGF ） 骨形态发生蛋白（ BMP ）,关节内注射TGF-对软骨细胞代谢和软骨生成的影响,采用TGF-修复软骨的不同策略,第四节 组织工程化关节软骨的临床应用,Pagets病 （变形性骨炎）,先天性或代谢性疾病,直接或间接的创伤性软骨缺损,关节镜下的软骨缺损,1987年，Britterg完成了第一例自体软骨细胞移植（Autologous Chondrocyte Implantation ，ACI）加骨膜覆盖的临床应用。 目前，全世界已经超过10000例，且有随访210年1200例病例回顾