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消毒与灭菌,人类和病原微生物作斗争的重要手段 进行微生物研究的一项基本技术,Sterilization and Disinfection,disinfection (消毒)： destruction of pathogenic microorganisms sterilization (灭菌)： destruction or elimination of all microorganisms antisepsis (防腐)： destruction or prevention of growth of pathogenic microorganisms,this for external use bacteriostasis（抑菌）： prevention of growth of pathogenic microorganisms,this for external or internal use asepsis（无菌）： Without alive microorganisms,Means of Sterilization/Disinfection,Physical means Chemical means Biological means,热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 超声波杀菌法 干燥与低温抑菌法,物理消毒灭菌法,Mechanism of Heat ：,脱水干燥 菌体蛋白的变性 细胞膜的损伤 DNA的断裂 低温:能抑制细菌生长，常用作保存菌种。,Physical means：Heat,Heat Dry heat and Moist heat At the same temperature， Moist heat is more efficient and rapid 原因： 蛋白质容易凝固 湿热穿透力大 蒸汽的潜热,湿热灭菌与干热灭菌效果比较,湿 热 干 热 穿 透 力 较大 较小 凝固蛋白所需温度 较低 较高 蒸汽凝结成水 放出潜热2.2567kJ/ml 无,1）焚烧：废弃物、尸体 灭菌迅速，彻底可靠，但易焚毁物品 2）灼烧：接种环、接种针、镊子、试管口和瓶口、玻璃涂棒等 3）干烤 （160170 ，2hr）：玻璃器皿、金属用具等 注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在180； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70时才开箱门。 4）红外线（0.77 1000um）：医疗器械,DRY HEAT,Moist Heat,煮沸消毒法(Boiling water),100,1015min 加入1%NaHCO3或2%Na2CO3或25%苯酚，效果更好。 适用于注射器和动物解剖器械的消毒,巴氏消毒法(Pasteurization),法国微生物学家巴斯德首创，既保持食物的营养和风味，又进行了消毒。 低温维持法（LTH）：62，30min 高温瞬时法（HTST）：72，1530sec 超高温瞬时法（UHTS）：135-150 ,2-8sec 可杀灭无芽孢的病原菌 用于食品工业中牛乳、啤酒、果汁、酱油等消毒,间歇灭菌法,（丁达尔灭菌法、分段灭菌法） 100 30min37 保温1824h 100 30min37 保温1824h 100 30min 适用于不耐热的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基的灭菌。,高压蒸汽灭菌(autoclave),121.3，1530min（压力103.4kPa）,适用于各种耐热培养基、水的灭菌，也适用于玻璃器皿、橡胶制品、工作服等物品的灭菌。 影响灭菌效果的因素： 1.微生物种类、数量、菌龄 2.空气排除程度 3.灭菌对象的体积：影响热传导速率 500ml,17-22min; 1000ml,20-25min; 2000ml,30-35min 4.培养基成份与组成：蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性； pH在7附近，抗热性最强；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。 5.加热与散热速度,高温对培养基成分的影响,产生沉淀：如多肽类、磷酸盐、碳酸盐 破坏营养，提高色泽：如氨基酸，糖类 降低pH值 改变培养基浓度,改进措施,成分分别灭菌：如糖；Ca2+、Fe3+与PO43- 低压灭菌：112,15min 间歇灭菌 过滤除菌 加入0.01%EDTA或0.01%NTA可防止金属离子沉淀,高压蒸汽灭菌效果的监测,工艺监测（程序监测）： 根据安装在灭菌器上的量器（压力表、温度表、计时表）、图表、指示针、报警器等，指示灭菌设备工作正常与否。,化学指示监测： 利用化学指示剂在一定温度与作用时间条件下受热变色或变形的特点，以判断是否达到灭菌所需参数。常用的有： 自制测温管： 将某些化学药物的晶体密封于小玻璃管内（长2cm,内径12mm）制成。常用试剂有苯甲酸（熔点121123）等。灭菌时，当温度上升至药物的熔点，管内的晶体即熔化，事后，虽冷却再凝固，其外形仍可与未熔化的晶体相区别，此法只能指示温度，不能指示热持续时间是否已达标，因此是最低标准。主要用于各物品包装的中心情况的监测。 3M压力灭菌指示胶带： 此胶带上印有斜形白色指示线条图案，是一种贴在待灭菌的无菌包外的特制变色胶纸。其粘贴面可牢固地封闭敷料包、金属盒或玻璃物品，在121经20分钟，130经4分钟后，胶带100变色（条纹图案即显现黑色斜条）。3M胶带既可用于物品包装表面情况的监测，又可用于对包装中心情况的监测，还可以代替别针，夹子或带子使用。,生物指示剂监测： 利用耐热的非致病性细菌芽胞作指示菌，以测定热力灭菌的效果。 菌种用嗜热脂肪杆菌，本菌芽胞对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽胞相似。生物指示剂有芽胞悬液、芽胞菌片以及菌片与培养基混装的指示管。 检测时应使用标准试验包，每个包中心部位置生物指示剂2个，放在灭菌柜室的5个点，即上、中层的中央各一个点，下层的前、中、后各一个点。 灭菌后，取出生物指示剂，接种于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，置5560温箱中培养48小时至7天，观察最终结果。若培养后颜色未变，澄清透明，说明芽胞已被杀灭。达到了灭菌要求。若变为黄色混浊，说芽胞未被杀灭，灭菌失败。,高压蒸汽灭菌和烘箱灭菌录像,高压灭菌和干热灭菌5：46.avi,Ultraviolet Light（200-300nm）,机制：使同一股DNA上相邻的胸腺嘧啶形成二聚体(pyrimidine dimers)，影响DNA复制；形成氧自由基（03.，H2O2.） 实验室、无菌室、接种箱等的空气消毒：每10m3空间用30W紫外灯照10min 物体表面消毒：紫外灯与物体的距离1.2m 先喷以35%苯酚或用23%来苏尔擦洗效果更好 缺点：穿透力弱；损伤眼睛和皮肤。,Physical means：Radiation,Ionizing Radiation,高速电子、X射线、射线（如60Co)等 直接破坏或产生强自由基(Free radicals)间接破坏DNA、蛋白质和酶。 穿透力强，可在包装后灭菌。 用于不能加热的塑料针筒、导管、薄膜、人造组织器官的灭菌；食品保存。,915MHz2450MHz的电磁波 可使物质中偶极子(如水分子) 产生高频运动,从原来的随机分布状态转向依照电场的极性排列取向。而在高频电磁场作用下，这些取向按交变电磁的频率不断变化，这一过程造成分子的运动和相互摩擦从而产生热量，从而使体内蛋白质同时受到无极性热运动和极性转动两方面的作用，使其空间结构变化或破坏，而使蛋白质变性失去生物活性，从而将存在的微生物杀灭。 速度快、加热均匀、穿透性强 用于非金属器械的消毒 与红外线加热方法相比,具有作用温度低,所需时间短等优点,Physical means：MICROWAVES,微波与红外线消毒方法的比较 项目 微波照射 红外线照射 作用温度 100 160180 作用时间 520 min 60120 min 热均匀度 内外均匀 外高内低,强光脉冲波技术,由PurePulse 技术公司开发。用相当于地面日光20 000倍强度的白色光线作短暂的脉冲式照(氙气灯) ,达到消毒目的。 所用光线中含紫外线25 % ,可见光45 % ,红外光30% 每一脉冲持续时间为200300s 经数次闪烁照射，当功率为1. 5 J / cm2 时,可使金黄色葡萄球菌减少107 以上;功率为4. 0 J / cm2 时,对枯草杆菌芽孢亦可达上述杀灭效果。 可用于包装外表面、空气和水的处理,Physical means： purebright technology,是利用频率在20200kHz的声波作用下，使细菌细胞机械破裂和原生质迅速游离，达到消毒目的。 目前主要用于破碎细胞以分离提取细胞组分或制备抗原。 超声洗手器，用于手的消毒。 超声洗涤机，用于注射器的清洁和初步的消毒处理,Physical means：Ultrasonic,用物理阻留的方法，将液体或空气中的微生物除去,以达到除菌目的。 用于不耐热液体的除菌，如血清、酶类、抗生素、糖溶液、细胞培养液等 优点：不破坏培养基成分 缺点：只适用少量滤液。 空气微粒过滤：无菌室，超净工作台 病毒、立克次体、支原体仍能通过。,Physical means：FILTRATION,赛氏(Seitz)滤器:石棉板滤器 K型澄清 EK型滤除细菌 EKS型滤除大病毒 微孔滤膜滤器 硝酸纤维酯和醋酸纤维酯混合物制成的薄膜 孔径0.02510m,过滤细菌用0.22 m 有针式和漏斗式,过滤除菌录像（5:05）,过滤除菌5：05.avi,antiseptics (防腐剂) disinfectants (消毒剂) bactericidal agents (杀菌剂) sporecidal agents (杀芽胞剂),Chemical means,Be ranked by germicidal activity,High level:将包括细菌芽胞的各种微生物全部杀灭或清除,使达无害化的处理(不需达灭菌水平) 戊二醛、甲醛、环氧乙烷、H2O2、过氧乙酸 Intermediate level:将细菌繁殖体(包括结核杆菌) 、多数病毒、多数真菌杀灭或清除使达无害化的处理,但不一定需杀灭细菌芽胞 含氯消毒剂、漂白粉（次氯酸钙）、 优氯净（二氯异氰尿酸钠）、乙醇、 碘和碘伏（Iodophors，聚乙烯吡咯烷酮碘）、 low level:杀灭或清除多数细菌繁殖体以及某些病毒和真菌的处理,但不依赖其杀灭或清除抗力强的微生物 来苏儿、洗必泰、新洁尔灭,Germicidal Activity of Chemicals,A number of germicidal chemicals,1、Phenols（石炭酸、来苏尔、洗必泰） 低浓度：破坏细胞膜；高浓度：凝固蛋白质 2、Alcohols（乙醇、异丙醇） 去除脂类;变性蛋白 3、Heavy metals 结合菌体蛋白、结合酶的-SH 4、Oxidants（H2O2、过氧乙酸、高锰酸钾、卤素） 氧化、蛋白变性 5、Surface-active agents（新洁尔灭、杜灭芬） 蛋白变性，细胞膜损伤 6、烷化剂（甲醛、环氧乙烷、戊二醛） 烷化蛋白和核酸 7、染料（龙胆紫） 干扰氧化、抑制繁殖,Mechanisms of Action,.Denature or oxidize proteins 酚类（高浓度）、醇类、重金属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类 2. Destroy cell membranes 表面活性剂、酚类（低浓度）、醇类、脂溶剂 3. Destroy enzymes and block the metabolism 重金属类（Hg2+、Ag+）（低浓度） 氧化剂（碘酊、H2O2、次氯酸） 烷化剂（甲醛、戊二醛、环氧乙烷）,常用杀菌因子对HIV 污染物消毒使用的剂量 HIV病毒对杀菌因子抵抗力低,消毒处理容易 。 杀菌因子 剂量 热（80 ） 72 h 紫外线（15 W灯管,距10 cm 处照射） 8 min 含氯消毒剂（含有效氯500-5000 mg/ L ） 10 30 min 碘伏(含有效碘50100 mg/ L ) 1030 min 乙醇65 %75 %溶液 510 min 过氧化氢3 %溶液 1030 min 戊二醛2 %溶液 2030 min 甲醛5 %8 %溶液 2030 min 煤酚皂溶液1 %3 %溶液 1030 min 季铵盐类0. 1 %0. 2 %溶液 30 min 以上,Prion的灭活,朊病毒：无核酸结构,但在宿主细胞内增殖感染性蛋白质 对化学因子的抵抗力是所有微生物中最强的 侵犯中枢神经组织,可引发慢性退行性脑组织病变，如克雅氏病、库鲁病 、致死性家族遗传性失眠症 、疯牛病等 134 高压蒸汽处理1h 5%次氯酸钠浸泡1h 1mol/L的氢氧化钠浸泡1h,Factors that influence the activity of antiseptics and disinfectants against microorganisms,消毒剂,微生物,环境,种类,浓度,作用时间,菌龄,种类,有机物,温度,酸碱度,化学消毒灭菌剂的使用原则,根据物品的性能及病原体特性，选择合适的消毒剂。 严格掌握消毒剂的有效浓度、消毒时间和使用方法。 需消毒的物品应洗净擦干，将其浸没于溶液里。 消毒剂应定期更换，挥发剂应加盖并定期测定比重，及时调整浓度。 浸泡过的物品，使用前需用无菌等渗盐水冲洗，以免消毒剂刺激人体组织。,常用化学消毒灭菌方法,浸泡法 选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性消毒剂，将物品浸没于消毒剂内，在标准的浓度和时间内，达到消毒灭菌目的。 擦拭法 选用易溶于水、穿透性强的消毒剂，擦拭物品表面，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。 薰蒸法 加热或加入氧化剂，使消毒剂呈气体，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。,喷雾法 借助普通喷雾器或气溶胶喷雾器，使消毒剂产生微粒气雾弥散在空间，进行空气和物品表面的消毒。如用1漂白粉澄清液或0.2过氧乙酸溶液作空气喷雾。对细菌芽胞污染的表面，每立方米喷雾2过氧乙酸溶液8ml经30分钟（在18以上的室温下），可达99.9%杀灭率。 环氧乙烷气体密闭消毒法 将环氧乙烷气体置于密闭容器内，在标准的浓度、湿度和时间内达到消毒灭菌目的。包括柜室法或丁基橡胶袋法。,常用化学消毒剂使用方法,1.乙醇 Alcohol 消毒水平：中效 作用原理：使菌体蛋白凝固变性，但对肝炎病毒及芽胞无效 使用范围： 1.以7075溶液作为消毒剂，多用于消毒皮肤和实验仪器 2. 95溶液可用于燃烧灭菌 注意点： 1.易挥发需加盖保存并定期调整其浓度 低于70浓度则消毒作用差 2.因有刺激性 不宜用于粘膜及创面的消毒,2.碘 酊 Tr.lodin 消毒水平：高效 作用原理：使细菌蛋白氧化变性能杀灭大部分细菌 真菌芽胞和原虫 使用范围： 2溶液用于皮肤消毒，擦后20s再用75乙醇脱碘 注意点： 1.对皮肤有较强的刺激作用， 高浓度不能用。 2 .皮肤过敏者禁用。,3.苯扎溴铵 消毒水平：低效 作用原理：是阳离子表面活性剂， 能吸附带阴电的细菌 ，破坏细菌的细胞膜，最终导致菌体自溶死亡，又可使菌体蛋白变性而沉淀。 使用范围： 1.0.010.05溶液用于粘膜消毒 2 0.1%-0.2%溶液用于皮肤消毒 3 0.1%-0.2%溶液用于消毒金属器械，浸泡1530min (加入0.5亚硝酸钠以防锈) 注意点： 1 对肥皂、碘、高锰酸钾等阴离子表面活性剂有拮抗作用 2 有吸附作用，会降低药效，所以溶液内不可投入纱布棉花等,4.洗必太 Hibitane 消毒水平：低效 作用原理： 具有广谱抑菌杀菌作用 使用范围： 1. 0.02溶液用于手的消毒，浸泡3min 2. 0.05溶液用于创面消毒 3. 0.1溶液用于物体表面的消毒,5.福尔马林（3740的甲醛溶液 ） 消毒水平：高效 作用原理： 菌体蛋白变性，酶活性消失。能杀灭细菌真菌，芽胞和病毒 使用范围： 1. 空气消毒加热法：取福尔马林12.5ml/m3 加入等量水，加热蒸发成气雾待药蒸发完毕断绝热源 继续封闭6h以上。 2 .熏柜消毒加热法：取福尔马林4080ml/m3 柜内置电灯泡 通电加热，密封熏蒸324h。 3 .氧化法 取福尔马林10ml+高锰酸钾5g/m3密封熏蒸6 h 以上 注意点：熏蒸穿透力弱，衣服最好挂起消毒,6.环氧乙烷 Ethylene Oxide 消毒水平：高效 作用原理： 与菌体蛋白结合，使酶代谢受阻而导致死亡 能杀灭细菌 真菌 病毒 立克次体和芽胞 使用范围： 用于电子仪器和不耐高温物品如皮革.皮毛.化纤织物， 一次性高分子医疗器材等的灭菌处理 常用剂量为0.12%-0.8%,温度为2037，时间为624h。投药量为0.4-0.8kg/m3 注意点： 1. 此药易燃易爆 且有一定毒性，必须熟悉使用方法并严格遵守安全操作程序 2 .放置阴凉通风，无火源及电源开关处，严禁放入电冰箱 3. 贮存湿度不可超过40，以防爆炸 4 .灭菌后的物品应清除环氧乙烷残留量后方可使用,7.过氧乙酸 Peracetic Acid (P.A.A.) 消毒水平：高效 作用原理：能产生新生态氧.将菌体蛋白质氧化.使细菌死亡.能杀灭细菌.真菌.芽胞.病菌 使用范围：1. 0.2溶液用于手的消毒浸泡12min 2. 0.2-0.5溶液用于物体表面擦拭或浸泡10 min 3. 0.5溶液用于餐具消毒 浸泡3060min 4. 12溶液用于室内空气消毒 注意点： 1. 浓溶液有刺激性及腐蚀性. 配制时要戴口罩和橡胶手套.须谨慎防止溅到它处 2 .因腐蚀性强.不宜用金属器皿盛装 3 .存于阴暗处，防高温引起爆炸 4 .易氧化分解.可降低浓度和杀菌力.故须现配现用,8.漂白粉 Chloriole of lime 消毒水平：中高效 作用原理： 在水溶液中放出有效氯，破坏细菌酶的活性而致死亡。能杀灭各种致病菌 .病毒.芽胞 使用范围： 0.5漂白粉澄清液用于餐具消毒，浸泡30min 2. 12澄清液用于肝炎患者的餐具消毒，浸泡12h 3. 13澄清液喷洒（100300ml/m3）消毒30min后通风或擦拭病室物品及厕所 注意点： 配制的澄清液性质不稳定. 密封保存时间不可超过1周 有腐蚀及退色作用 .不宜用于金属制品 .有色衣物及油漆家具。 布类消毒后应立即清洗 .以防被腐蚀,9.过氧化氢（双氧水） 消毒水平：高效 作用原理： 过氧化氢能破坏蛋白质的基础分子结构从而具有抑菌与杀菌作用 使用范围：1025溶液用于物体表面消毒 注意点： 易氧化分解 降低浓度.应存于阴凉处.不宜用金属器皿盛装,选择适当的消毒剂,低毒,价廉,低破坏,易贮藏,方便,有效,近年化学消毒研究进展,理想的消毒剂,广谱杀菌能力 作用迅速 方便及可溶于水中 稳定 能抵受污垢、硬水等 环保及不含有毒物质 不含腐蚀性 经济 使用安全,近年化学消毒研究进展,过氧化氢 过氧化氢溶液浓度增加到100 % ,可杀灭细菌芽孢,并无残留毒性 二氧化氯 杀菌作用较过氧化氢强,不仅可直接用化学药物反应产生,而且还有二氧化氯电解发生器,从而既可使用溶液亦可使用气体进行消毒和灭菌 “