酶工程的一些概念总结.doc

一，酶工程基础酶工程是将酶，细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会科学的一门科学技术。二、催化作用及影响因素共价调节酶蛋白分子上的某些残基，在另一种酶的催化下进行可逆的共价修饰，从而使酶在活性和非活性之间相互转变的过程。别构调节某些小分子物质与酶的非活化性部位或别位特异性的结合引起酶蛋白构象的变化从而改变酶的活性。协同效应一个效应物分子与酶的别构中心结合后，对第二个效应物分子的影响称为协同 。酶活力的单位U在特定条件下(25C，最适底物浓度，最适T，pH和离子强度)，美发每分钟内能转化1umol底物反应或催化1umol产物形成所需的酶量，称为1个酶活力的单位。催量kat在最适条件下每秒钟能使1mol/L底物转化为产物所需的酶量。1kat=610(7)U酶的比活力 在特定条件下，单位质量pr或RNA所拥有的酶活力单位数。既=酶活力(单位)/mg(Pr或RNA)酶的转换数(分子活性或摩尔催化活性) 单位时间内，酶分子的每个活性中心或每个分子酶所能转化的底物分子数，单位min-。摩尔催化活性=n催化中心活性。酶的催化周期 酶进行一次催化所需要的时间。与转换数互为倒数。六大类酶 水解，裂合，连接，转移，氧化还原酶，异构。按组成分类 单体酶，寡聚酶，多酶复合体(多种酶彼此嵌合形成复合体，可催化连续反应。)邻近效应 酶与底物之间具有亲和性，底物有向酶活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，底物在酶的活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做邻近效应。定向效应 底物向酶的活性中心靠近，诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团间的分子轨道以正确方向严格正确定位使酶促反应易于进行。酶的生产 通过人工操作获得所需酶的技术过程。(以下为三种方法)提取分离法 采用各种提取分离纯化技术，从动植物组织器官细胞或微生物细胞中将酶提取出来再进行分离纯。生物合成法 利用微生物细胞，动植物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术工程。有机合成法 利用有机合成技术合成出我们所需酶的技术。三、发酵工程操纵子 在原核基因组中由几个功能相关的结构基因及其调控区(启动区+操纵基团)组成的一个基因表达的协同单位。这个基因表达的协同单位既为操纵子。辅阻遏物：凡是能引起反馈阻遏的物质。效应物：是一类低相对分子质量的信号物质。诱导物：是一类能促进诱导酶产生的物质。调节蛋白，是一类变构的蛋白质，存在两个特殊位点，一个与操纵基因结合，一个与效应物结合。阻遏物，只有在没有诱导物时与操纵斯因结合的调节蛋白，又称阻遏蛋白。阻遏物蛋白，当辅阻遏存在时与操纵基因结合的调节蛋白，又称调节蛋白原。CAP，降解物基因活化蛋白或分解代谢物基因活化蛋白或CAMP受体蛋白CRP。葡萄糖浓度高时，CAMP浓度低，CAP与CAMP不能结合形成复合物与启动基因P结合，RNA聚合酶不能与启动基因结合，结构基因不能被转录，降解乳糖的酶不能被合成。色氨酸浓度高时，核糖体很快通过1区，停止在终止密码子处，封闭2区。3丶4区碱基配对形成发夹结构，形成哀减子结构，这是一个很强的终止子结构，终止转录。诱导，凡是能够促进酶生物合成的现象都称为诱导。细胞在外来底物或底物类似物诱导下合成的。阻遏，凡是能阻碍酶生物合成的现象称为阻遏。安慰诱导剂，酶的底物结构类似物，不能作为基质而被转化，这样的诱导物称为安慰诱导剂。协同诱导，和顺序诱导先后诱导合成，分解底物的酶和分解其后中间代谢产物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。反馈(产物)阻遏，酶催化作用的产物或者是代谢途径的末端产物，使该酶的生物合成受阻的过程。分解代谢物阻遏(葡萄糖效应)，微生物在含有2种能够分解的底物的培养基中生长时，利用快的分解底物会阻遏利用慢的分解底物有关酶的生物合成的现象。端粒，真核细胞染色体末端具有的特殊结构，是许多成串的、短的重复序列。可以稳定染色体。端粒酶，是一种延长端粒末端的核糖体核蛋白酶，是核蛋白逆转录酶，含有引物特异识别位点，以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，延长端粒，增强细胞的寿命，甚至使其永生。出发菌株，用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的菌株。诱变剂，凡是能够诱发生物基因突变并且突变频率远远超过自发突变的物理或化学因子。超诱变剂，烷化剂中，甲基磺酸乙酯和亚硝基胍称为超诱变剂，是毒性最小的诱变剂之一。中间培养，把诱变处理后的细胞在液体培养基中培养，细胞的遗传物质得到复制，繁殖几代就可以得到纯化的变异细胞，此时隐性的变异就会显现。直接亲本，原生质体融合育种中具有遗传标记而直接用于杂交配对的菌株。CM完全MM基本LM有限SM补充遗传标记。营养缺陷型*，抗性*，灭活*，荧光染色*，温度敏感*。原生质体再生率，生长因子，细胞正常代谢必不可少，且不能用简单的碳氮源自行合成的有机物。临界氧浓度，各种微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个不影响其正常代谢最低要求，这一称为rc,摄氧率：单位体积的培养液中的细胞在单位时间内所消耗的氧气量。等于QO2 Cc。前者代表单位细胞量在单位时间内耗氧量，后者代表单位体积培养基的细胞量。四、酶的分离工程凝聚，在电解质作用下，胶粒之间双电层排斥电位降低使胶体体系不稳定，胶体粒子之间由于相互碰撞产生凝集，这一现象叫絮凝，在某些高分子絮凝剂的作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小凝固团的过程。(常用聚丙烯酸氨类)助滤剂，一种不可压缩的菱孔微粒，能够使滤饼疏松从而增加滤速。差速离心，采用不同的离心速度和离心时间使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。密度梯度离心法，用一定的介质在离心管中形成一个连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质当中，通过重力或离心力场的作用使之分离。沉淀分离，通过改变条件或者加入某种试剂，使溶液中目的酶的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出与其它溶质分离的技术。盐析沉淀法，采用加入中性盐使各种蛋白依次分别沉淀的方法。有机溶剂沉淀法，利用酶等蛋白在有机溶剂中的溶解度的不同而达到分离的方法。选择性变性沉淀法，杂蛋白沉淀而目的酶不受影响的方法。萃取分离，液相或固相中的溶质经过某些方法转移至另一液相的过程。溶剂萃取，是一种利用样品中各组分在两相中溶解度或分配系数的不同，达到分离和纯化目的技术。反萃取，调节水相条件将产物从有机相转入水相的萃取操作。双水相，两种或两种以上的物质的水溶液，在一定浓度下混合形成的具有清晰界面而且平衡共存的两个液相称为双水相萃取，利用样品中各组分在两种互不相溶的双水相液层中的分配系数的不同实现分离目标组分的技术。反胶束，表面活性剂在非极性的有机溶剂中形成，极性头向内，非极性尾向外，含有水分子，内核的纳米级透明，并且热力学稳定的聚集体，这个聚集体称为反胶束萃取，利用反胶束将酶或其他蛋白从混合样品中萃取出来的分离技术。助表面活性剂，能够改变表面活性剂的表面洗性以及亲水亲油平衡性，参与形成胶束，调整水和油的极性，水溶性的酶可以减小水的极性，油溶性的酶可以增大油的极性，从而影响体系的相态和极性的微乳成分。相比，流动相体积/固定相体积。超临界流体，处于临界压力和临界温度以上，介于液体和气体之间的高密度流体状态。超临界流体萃取，利用超临界流体作为萃取剂，从液、固体中萃取出特定成分，以达到某种分离目的。过滤，利用过滤介质将不同大小，不同形状和不同特性的物质进行分离的技术。粗滤，借助过滤介质截留悬液中直径大于2um的大颗粒，使固液分离的过滤技术。膜分离，利用一种特殊的具有选择性透过功能的分离膜，使流体的一种或几种透过而其他物质不透过，从而起到浓缩和分离纯化目的的技术。透析，用半透膜将液体分为两半，一半是要分离的混合液，另一半是水或缓冲济，混合液中的大分子因不能透过半透膜被截留在膜内，可透析的小分子经过扩散作用不断透过膜而互相渗透，这种技术称为超滤膜，一层是较蒲具有一定尺寸孔径的分离层，一层是较厚具有海绵状或指状结构的多孔层。常需较大压力。中空纤维系统超滤装置，由多根空心纤维丝成束的装配组成，每根纤维丝相当于超滤，滤速更高。微滤，用于悬浮液，粒径0.2-2um，广泛用于菌体细胞的分离浓缩。层析分离，也叫分子筛层析或排阻层析，利用生物大分子的相对分子质量的差异来进行层析分离的一种方法。外水体积Vo：一根凝胶柱中颗粒间自由空间所含的水的溶液的体积。内水体积Vi：凝胶颗粒内部孔穴总体积。Ve=Vo+KdVi,Kd是分配系数，表示溶质在固定相与流动相的浓度之比。Ve代表溶质流出柱所需流动相的体积。疏水层析，使疏水的配体通过疏水作用与样品蛋白疏水基团可逆性结合，实现分离的一种技术，又称疏水作用层析。原理，目的物带有疏水基团不同，疏水性不同，与配体的疏水作用不同，根据疏水作用的差异可将物质分开。亲和层析，又称功能层析，生物专一性吸附或选择层析。利用生物大分子与配体之间所具有的特异的可逆亲和力进行分离纯化的一种技术。反相层析，基于溶质极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。(液液色谱，键合色谱，流动相都为液极，固定相都为非极)。酶的干燥，将浓缩的酶中多余的微少量的水去除的过程。生物印记，天然材料在某分子印记上产生的特异性识别空腔。(化学范畴)七、生物酶工程定点突变，在基因特定位点引入突变，即通过取代，插入，或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列，来改变酶蛋白结构中某个或某些特定氨基酸，以此来提高酶对底物的亲和力，增强酶的专一性。融合酶，将两个或者两个以上的酶分子组合在一起所形成的融合蛋白。标签结构域，决定多肽分布的结构域，对疾病治疗有益。八，核酶定义，具有生物催化作用的核酸。分为剪接型(I型内含子， II型内含子)和剪切型(自我剪切型和异体剪切型)。适体选择，指数扩增法系统进化配体，指从顺序随机的RNA或DNA分子构成的大容量随机分子库出发，在其中筛选极少数具有特定功能的分子。适体，能与有机物或蛋白质等配体专一高效结合的RNA或DNA片段。基因治疗，用正常或野生型基因校正或置换致病基因的方法。(修复，将致病基因的突变简基纠正，正常部分保留。基因修饰，又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或者能够使原有的某些功能得以加强。基因失活，特异的封闭基因表达，抑制一些有害基因表达，以达到治病目的。免疫调节，将标记抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。二、催化作用及影响因素酶活性的调节 。共价调节，别构调节，前馈反馈作用调节，激素调节，同工酶作用，酶分子修饰，酶之间相互作用。酶活力测定方法。终止法，连续反应法。终止法底物产物的测定。化学法，放射性化学法，酶偶联法。研究酶活性中心的方法。化学修饰法(专一性修，非专一性修，亲和标记法)动力学 参数法，X线晶体学分析法。影响酶稳定的7个物理因素。温度，机械作用力，辅射与光氧化作用，压力，容器表面吸附，电场与磁场，酶浓度。三、发酵工程原核生物酶生物合成的调节。大肠杆菌操纵子，色氨酸操纵子。真核生物酶合成的调节。细胞分化(端粒酶)，基因扩增，增强子。菌种分离的步骤。1含菌样品的采集，2富集培养，3菌种的分离纯化，4产酶性能的测定(初筛，复筛)，5菌种的退化与复壮。菌种的活化与括大培养，1菌种的扩大培养，2种子制备的过程，3种子质量的控制(因素6，措施2)诱变育种步骤，出发菌株的选择和纯化，诱变剂的选择和纯化，中间培养，突变株的分离筛选。单孢子滤液制备步骤，接种霉菌于斜面培养一定时间，加一定量无菌蒸水或生理盐水，接种环搅拌，刮下菌丝体至含玻璃珠的无菌三角瓶，振摇，脱脂棉过滤。突变株分离筛选，1、分离筛选(据形态，浓度梯度法，复印技术，大通量筛选)2、摇瓶振荡培养(初11，复123瓶)3、产物活性测定(琼脂平板活性圏法，滤纸片法)4、培养基和培养条件调整。原生质体融合程序。1、直接亲本、培养基、和遗传标记的选择，2、原生质体的制备与再生，3、两亲本原生质体的诱导融合，4、融合重组体的分离，5、遗传特性分析与测定。筛选营养缺陷型步骤，1、诱变，2、淘汰野生型(抗生素法使缺陷型处于休止状态免于一死，菌丝过滤法缺陷型不长孢子状态)，3、检出缺陷型(影印法，点种法，夹层法)，4、营养缺陷生长谱测定，即测定缺陷因子(营养组合分区，缺陷菌株分区)。原生质体收集纯化，过滤法，密度梯度离心法，界面法，飘浮法。原生质体活性测定，荧光素双醋酸盐染色法(有荧光为活)，酚藏花红染色法(0.01%.红色为活，无色死)，伊文思兰染色法(0.25%.无色为活蓝为死)。原生质体的保存，低温下，液氮+二甲基亚酚DMSO或甘油。原生质体再生方法，双层平板法(下层2%琼脂的再生M,中间原生质体悬液，上层0.8%或0.4%半固态同成分培养液3-10mL)融合方法，聚乙二醇PEG(负极性，作分子桥；增强膜流动性)，电融合。pH对微生物代谢活性影响原因：1、细胞内代谢产生的OH-,H+影响酶蛋白解离度和电离情况，从而影响酶的结构功能，使酶活性改变。2、影响细胞对基质利用速度，以及细胞结构，影响菌体生长和产物合成。3、影响质膜电荷状况，使膜的通透性改变，从而影响细胞对营养物质的吸收和产物的形成。提高产酶措施，1、条件控制(添加诱导物，降低阻遏物浓度，促进细胞分泌-表面活性剂，添加产酶促进因剂)，2、遗传控制(改良菌种-诱变或原生质体融合，基因工程育种)四、酶的分离工程分离纯化方法优劣的判断，总活力回收率即酶损伤程度，比活力提高倍数即酶纯度。分离纯化一般程序，1.预处理即细胞破碎，原材料选择，发酵液预处理等。2.粗分级处理，又称初步分化，盐析萃取等，纯度低3.细分级处理，又称酶的精制，层析、吸附层析等，纯度高4.浓缩与干燥。发酵液相对纯化，无机离子去除(钙用草酸，镁用三聚磷酸钠生成络合物，三价铁用黄血盐生成普鲁氏蓝)，杂蛋白去除(沉淀法，变性法，凝聚和絮凝法，吸附法)，色素去除(活性碳)。影响发酵液固液分离因素，1.菌种，真菌放线菌细菌由不需到需预处理，2.各种发酵条件(培养基组成，未利用完的基，消泡剂，发酵周期)黏度影响。提高过滤性能的方法，凝聚和絮凝，加水稀释法(降低黏度)，加助滤剂，加反应剂，加酶。细胞破碎方法，1.机械法(机械捣碎法，研磨破碎法，匀浆破碎法，改进高压法，超声波破碎法)2.非机械法(酶溶法，化学渗透法，物理法，干燥法)细胞破碎确认，测破碎前后细胞数(染色)，测导电率(线性增加)，测释放蛋白量或酶活力(与100%破碎率的比较)。酶的提取方法，1.离心(差速，密度梯度)2.沉淀(盐析，等电点，有机溶剂，选择性变性)3.萃取(双水相，反胶束，超临界流体)4.过滤(常，加，减压)和膜分离(透析，超滤，微滤)5.层析(疏水层析，亲和层析，反相层析)6.电泳。影响透析的因素，浓度梯度，分子大小，温度，膜厚度，膜表面积。凝胶类型：1.葡聚糖(单体是葡萄糖，胶联剂是3氯1，2环丙烷)，2.琼脂糖(D半乳糖，3，6脱水L半乳糖，相间重复结合)，3.聚丙烯酰胺(单体是丙烯酰胺，交联剂是甲叉双丙烯酰胺，催化剂过硫酸铵，加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺)，4.sephacryl(烯丙烷基葡聚糖，共价交联，剂甲叉双丙烯酰胺),5.superdex(高交联度多孔琼脂糖珠体和葡聚糖共价交联)。凝胶过滤技术，1.层析介质选择，2.凝胶粒度选择，3.凝胶用量计算(干凝胶用量=柱容积/溶胀度，取时多取1020%，溶胀度单体：床体积/克)，4.凝胶处理，5.柱的选择，6.装柱，7.流动相选择，8.样液制备，9.上样，10！洗脱，11.柱体再生和保存。凝胶过滤应用，脱盐，分离提纯，测定高分子物质的相对分子质量，高分子溶液的浓缩。疏水介质，基质(可亲水可亲油，常用琼脂糖凝胶珠)和配基。疏水层析因素，盐(表面张力大则疏强，离子对强则疏弱洗脱强，盐析作用离子使疏强洗脱弱，盐溶作用离子使疏弱洗脱强)，离子强度(大则疏强)，pH，(接近等电点则疏强)，温度(温升则疏强)。疏水层析技术，层析柱的选择，固定相，装柱，加样洗脱，再生(8mol/mL尿素洗脱)亲和介质制备，1.配基选择(亲和力合适，复合物解离常数十的负四至负十次方，适当化学基团与载体接合且不与目的物特异结合)2.载体选择(不溶但亲水，化学惰性，颗粒均匀，多孔网状结构，物理化学性质稳定)3.活化剂，(指能够使载体产生自由基且与配体结合的物质)4.活化方法(2环氧化学方法，3酰胺衍生物法聚胺的活化，4硅化法复孔玻璃)5.封闭，剩余活化基团+伯胺基化合物(乙醇胺，甘氨酸)亲和层析分离过程，吸附条件选择(温升，离子强度强，pH低，亲力降)，洗脱条件选择(配与目亲和力弱中强)，洗脱方式，(一步，多步，梯度)，亲介质再生(盐酸胍，尿素，去活剂SBS冲洗)，影响因素(柱长，样液体积，上样速，温度)，亲法(共价，金属离子，染料，凝集素，核酸，串联即TapPrA,CBS,TEV蛋白酶)。电泳