2016年艾滋病抗体检测技术ppt课件

2016年艾滋病抗体检测技术培训,主要内容,一、艾滋病及其病原简介 二、艾滋病检测实验室设置与职能 三、艾滋病抗体检测技术 四、抗体检测流程 五、质量控制 六、生物安全防护,第一部分 艾滋病及其病原简介,2019/3/25,4,定义,艾滋病全名为获得性免疫缺陷综合症（Aquired Immunodeficiency Sydrome,AIDS）,该病由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus ,HIV）感染而引起，导致被感染者免疫功能的部分或完全丧失，继而发生机会性感染、肿瘤等。,2019/3/25,5,HIV发现 1981年美国首次报告病例（回顾87年） 1983年法国的巴斯德研究所首次在男同性恋者分离出淋巴腺病综合征相关病毒（Lymphadenopathy-associated 简称LAV）。 1984年美国Gallo等分离出HTLV- （嗜人类T淋巴细胞型病毒） 1986年国际微生物学会和病毒分类学会将HTLV-和LAV统称为人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus 简称HIV) 1986年分出HIV-2型,HIV-1 M组,HIV-1 O组,HIV-2,喀麦隆、加蓬,HIV型别和亚型的 分类进化与地区分布：,西非、印度,HIV,艾滋病病毒感染后，可严重破坏人体的免疫系统，使人体丧失抵御各种疾病的能力，有利于各种病原体的侵入，从而导致各种严重的、难以治愈的机会性感染或肿瘤，最终导致死亡，病死率可达100。,艾滋病从感染到发病的一般过程,急性期,潜伏期,窗口期,HIV感染以后的血清学动态,Anti-P24,Anti-gp41/120 (anti-gp36),HIV RNA,Anti-Ag,感染 1周 2周 3周 4周.1年 2年 3年.10年,艾滋病期,Anti-Ab,浓度,窗口期: 从机体感染HIV到产生相应抗体的这段时间叫窗口期，一般平均为13个月，95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后3个月以内，个别情况到6个月可检测。,第二部分 艾滋病检测实验室分级设置和职能要求,2019/3/25,14,艾滋病检测实验室分三类： 1、艾滋病参比实验室 2、艾滋病检测确证实验室:包括艾滋病确证中心实验室和艾滋病确证实验室 3、艾滋病检测筛查实验室:包括艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点,艾滋病参比实验室,设在中国疾病预防控制中心。其职能包括： 1、承担全国艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和评价工作。 2、建立全国艾滋病检测质量保证及质量控制体系，组织国家级实验室能力验证和艾滋病诊断试剂临床质量评估。 3、承担艾滋病检测疑难样品的分析和确证，对有争议的检测结果进行仲裁，出具最终检测报告。 4、开展应用性研究，承担与艾滋病防治相关的病原学鉴定、现场综合防治、调研、监测、临床治疗等工作中的相关检测任务。 5、建立国家艾滋病病毒毒种库、样品库、质控品库、基因库和细胞库。 6、为艾滋病确证中心实验室开展省级实验室质量管理、省级艾滋病诊断试剂临床质量评估和自愿咨询检测等工作提供技术支持和指导。 7、组织全国艾滋病检测相关业务培训，组织制定和修改与艾滋病检测工作有关的技术规范和指南。,艾滋病确证中心实验室职能,（1）负责职责范围内艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和评价，组织艾滋病检测实验室人员技术培训。 （2）建立艾滋病检测实验室质量控制体系，组织省级实验室能力验证和艾滋病诊断试剂的临床质量评估。 （3）承担省级卫生行政部门指定区域内的艾滋病病毒抗体确证、抗体筛查和其他艾滋病检测工作。 （4）开展应用性研究，承担与艾滋病防治相关的病原学鉴定、现场综合防治、调研、监测、临床治疗等工作中相关的检测任务。 （5）建立职责范围内的艾滋病检测样品库和质控品库。 （6）收集、整理和分析艾滋病检测数据及相关资料，建立艾滋病检测实验室基本资料库和艾滋病检测资料数据库。定期向省级卫生行政部门和中国疾病预防控制中心报告艾滋病检测数据及相关资料，并配合其做好个案调查、登记等随访工作。 （7）负责对开展自愿咨询检测工作的艾滋病检测实验室的技术支持和指导。,艾滋病确证实验室职能,（1）承担当地卫生行政部门指定的艾滋病病毒抗体确证、抗体筛查和其他艾滋病检测工作。 （2）及时向艾滋病确证中心实验室报告经确证的阳性结果，并配合其做好个案调查、登记等随访工作。 （3）承担当地卫生行政部门指定的艾滋病检测筛查实验室的业务技术指导、培训和评价任务。 （4）定期汇总艾滋病检测资料，并上报艾滋病确证中心实验室和同级卫生行政部门。 （5）协助艾滋病检测实验室开展自愿咨询检测工作，给予技术支持和指导。,艾滋病筛查实验室职能,(1)开展艾滋病病毒抗体的筛查试验，根据需要可开展其他艾滋病检测工作。 (2)负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反应的样品送当地艾滋病筛查中心实验室或艾滋病检测确证实验室。 (3)定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查中心实验室或艾滋病检测确证实验室。 (4)对自愿咨询检测工作提供技术支持。,艾滋病检测点职能,（1）开展艾滋病病毒抗体的筛查试验。 （2）负责将艾滋病病毒抗体筛查呈阳性反应的样品送当地艾滋病筛查实验室或艾滋病筛查中心实验室。 （3）定期汇总艾滋病检测资料，并上报当地艾滋病筛查实验室或艾滋病筛查中心实验室。 （4）开展艾滋病自愿咨询检测工作。,艾滋病检测筛查实验室的申请与验收,设立艾滋病检测实验室的机构或单位应向省级卫生行政部门提交申请书。 省级卫生行政部门组织专家组对申请材料进行审查，对符合规定、材料齐全的申请者，由省级（或市地级）艾滋病检测实验室验收专家组进行现场验收。省级卫生行政部门对通过验收者发出合格通知，同时抄送省级疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。 省级卫生行政部门在组织对采供血机构执业验收时，应选派艾滋病检测实验室验收专家组专家参加对采供血机构实验室的验收。采供血机构取得执业许可后，抄送省级疾病预防控制中心备案。 迁移艾滋病检测实验室或变更艾滋病检测实验室的类别，按本办法上述规定重新申请验收。,艾滋病筛查实验室基本标准,1、人员条件 至少由3名医技人员组成，其中具有中级卫生技术职称人员至少1名。负责筛查试验的技术人员需具有2年以上从事病毒性疾病血清学检测工作经验，接受过省级以上艾滋病检测技术培训，并获得培训证书。 2、建筑条件 实验室或检测区域应分为清洁区、半污染区和污染区，应符合二级生物安全实验室（BSL-2）要求。 3、仪器设备条件 配备艾滋病病毒抗体筛查试验所需设备，至少包括酶标读数仪、洗板机、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、离心机、加样器（仪）、消毒与污物处理设备、实验室恒温设备、安全防护用品和生物安全柜。,2019/3/25,22,艾滋病检测点基本标准 1、人员条件 至少由2名经过艾滋病检测技术培训并获得培训证书的专业人员组成。 2、建筑条件 需有艾滋病检测区域或专用实验台，能开展简便、快速检测。 3、设备条件 需配备快速试验所必须的物品，包括普通冰箱、消毒与污物处理设备、一次性消耗品、安全防护用品。,第三部分 艾滋病实验室检测技术,已废止,章节对比,修改、增补和完善的内容,1. 在样品的采集和处理中，增加了滤纸片干血斑样品、用于CD4/CD8 T淋巴细胞测定样品、尿液和唾液样品的采集和处理。 2. 在HIV抗体检测中，增加了免疫荧光法和化学发光法，进一步明确了不同情况下的检测策略。 3. 在HIV核酸检测中，增加了HIV感染产妇所生婴儿HIV感染早期诊断检测流程和适用于窗口期的集合核酸检测法。,修改、增补和完善的内容,4. 根据临床治疗需求，增加了HIV-1耐药检测。 5. 进一步完善了艾滋病检测实验室安全防护和艾滋病检测实验室的质量管理，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性。 6. 增加了HIV-1新近感染检测和HIV-1的分离培养技术。,艾滋病实验抗体诊断方法（一）,艾滋病实验诊断方法（二）,免疫渗滤试验 （金标法）,一、快速诊断试验：,滴50ul血清或血浆,滴50ul全血,滴1滴缓冲液,阳性 阴性 无效 无效,3-15分钟,免疫层析试验（硒标法）,明胶颗粒凝集试验（PA）：,PA的操作和结果判断,二、酶联免疫分析（ELISA） （第三代、双抗原夹心、两步法） 可检测多种抗体,化学发光法,待测抗体,酶标记的抗原,发光底物,包被抗原,1.缩短窗口期：3-4天 2.灰区结果减少。 3.国际主要HIV检测试剂评估：无论是第四代（Abbott），还是第3代试剂（bio-rad），化学发光试剂都排第一，国产科美。,时间分辨免疫荧光法,第四代：可同时检测抗原及抗体,区分ELISA真阳性与假阳性，确诊出阳性样本 针对各种病毒蛋白的特异抗体 检测HIV-1和HIV-2,HIV抗体确证试验,Western Blot 免疫印迹法,全自动免疫印迹仪,各种诊断试剂特点（对缩短窗口期的效能）,快速试剂,偏远地区 用于急诊手术 用于高危行为的门诊病人 即将分娩的孕妇 HIV职业暴露者,快速试验前滞现象： 指反应中抗体含量过多，影响抗原抗体的理想结合，大量抗体结合于抗原阻碍了交叉联结符 合体的形成，使肉眼观察不到凝集现象。造成假阴性。 解决办法：稀释样品,抗体筛查试验的局限性,阴性结果不能排除HIV感染：在感染早期，血清阳转前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗体可能检测不到（如p24抗体）。反应中抗体过量，抗原抗体比例不合适而不能形成特定结购，出现凝集抑制。 不能诊断18月龄婴儿的母婴垂直感染 新出现的亚群难以检测,HIV抗体筛查流程,抗原抗体联合试剂,以诊断为目的的检测策略-常规筛查,血液、血浆、干血斑、唾液、尿液,ELISA、免疫荧光或化学发光、RT,初筛复核阳性样品，可直接确认,调整了筛查试剂的选择： 对快速法提供了适用性指引：应急检测、门诊急诊。 调整了复检试剂的选择： 如初筛时使用了Ag/Ab试剂，复检时必须包括这类试剂。,筛查试验和复检意义,筛查试验：诊断出阴性样本， 为阳性/可疑样本排除非特异条带。 复检1（试剂A）：对阳性/可疑样本排除操作误差 复检2（试剂B）：对阳性/可疑样本排除试剂误差 检测结果：阴性/阳性 样本上送：阴性者不需上送确证，阳性/可疑样本上送 最好采集第二份样本一同上送,HIV抗体筛查检测结果报告,筛查（-）：出具“HIV抗体阴性”报告 筛查（+）：出具“HIV抗体待复查”报告 不能出阳性报告,抗体确认检测流程,免疫印迹试验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验、免疫荧光试验,血清、血浆、干血斑,09版,抗体确认结果 结果判断应根据技术规范、并结合试剂说明书进行。 确证试验结果有：阳性、阴性、不确定。 结果为“阳性”表明已感染HIV，以后不需再复查。 结果为“阴性”表明未发现HIV感染。 结果为“不确定”表明目前未能判断是否感染，应继续进行追踪观察。 造成“不确定”的原因： 1、处于感染初期，抗体水平不高； 2、正常人群与p24交叉概率为1015%； 3、个别人群、个别样本有干扰。,艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程,样品采集和处理要求,样品种类及相应的用途,1.全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测。 2. 抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。 3.血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药检测。DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。 4.全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血淋巴细胞（PBMC）及DBS样品可用于HIV核酸的定性检测。 5.PBMC、全血、淋巴细胞富集液等可用于HIV-1分离培养。,样品的采集,滤纸片干血斑样品：全血、末梢血、血浆，滴于印圈（直径1cm左右）中间，采集多个圈，干燥后单独包装。 优点：所需样本量少和便于采集，末梢血即可；运输不需冷链，不需3级包装；滤纸样本干燥后不再具有传染性，减少生物危害。 尿液和唾液样品的采集和处理。 尿液：用干净的容器，一般2-8 C保存 唾液：用试剂盒提供的容器，存放时间是否冻存根据说明书,样品的保存,用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于28， 一周以上应存放于-20以下。 用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可存放于4，3个月以内应存放于-20以下。3个月以上应置于-70以下 筛查实验室阳性样品上送，阴性样品可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存12个月。特殊用途或专项项目按具体需要决定。 确证实验室的阳性、阴性、不确定样本均保存10年。,样品的运输,用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送 用于CD4/CD8 T淋巴细胞测定样品：室温下运输1825 C，特殊情况4 C，DBS样品室温运送1825 C 。 运输应符合生物安全要求：获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。 运送必须有记录 特殊情况下，经有关部门批准可以快递，但必须三层包装，严禁用玻璃容器。,上送确证标本表格要求,抗体待复检申请单 抗体筛查报告 标本信息登记表（EXCEL格式）一式三份，上送确证标本前，电子版发确证实验室邮箱,1 同名同姓问题 2 重复检测问题 3 随访问题,样品的接收,样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼镜的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送样人。 接收样品时应填写样品接收单。,艾滋病检测实验室信息网报,月报 每月5日前完成网络直报,HIV-1抗原检测,增加了HIV-1 P24抗原检测的意义 略掉了p24抗原筛查程序 详细了p24抗原确认程序 增加了质量保证和质量控制,HIV1P24 抗原检测的意义,1 HIV-1 感染窗口期、HIV 抗体不确定或HIV-1 阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。 2 第四代HIV 检测试剂的阳性结果的辅助诊断。 3 监测病程进展或抗病毒治疗效果。 4 HIV 分离培养，病毒复制状况的监测。,检测方法及程序,1 试剂：抗体夹心ELISA 方法，应使用经国家药品监督管理局批准注册的试剂。 2 样品：血清、血浆或病毒培养上清液。 3 方法：筛选试验、确证试验（中和试验）、定量检测（标准曲线法）,确证试验过程,P24 抗原的中和试验，用于排除筛选试验的假阳性。 待检样品先与中和剂（P24 抗原的抗体）共同孵育，如果样品中存在P24 抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。 然后，用这样处理过的样品重复筛选实验的步骤，同时做一孔未中和的原始样品对照。 将中和与未中和孔的OD 值进行比较，如果中和孔的OD 值下降50 % 以上，认为样品中的P24 抗原是真正的阳性；如果中和孔没有出现OD 值的下降，认为P24 抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA 检测或随访做进一步确证。,HIV核酸检测,核酸检测的意义 婴儿早期诊断 疑难样本的辅助诊断 遗传变异：分子流行病学调查、人群HIV遗传变异趋势 病程监控和预后 指导病毒治疗及治疗效果， 定性检测：提取、扩增、电泳 定量检测：商品检测系统 RT-PCR bDNA NASBA 集合核酸定性检测：对高度怀疑感染人群且抗体阴性的样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染者,HIV核酸检测-HIV感染产妇所生儿童早期诊断检测流程,3个月12个月则按抗体检测流程，若抗体为阳性，不能凭此判断阳性，应尽快在不同时间采集2份血进行核酸检测,第六部分 质量控制,抗体检测的室内质量控制,试剂盒内部对照：用于判断每次实验的有效性 室内质控品：监控检测的重复性而设置，可以是商品或自行配制 绘制质控图 质控图的分析及失控处理,快速试剂质控,内对照有效 外部对照：可采用商品或自制的，不能使用ELISA的外部质控品，可用本室保留阳性样本。 下列情况需做质控：更换批号、更换检测人员、更换包装、更换厂家。 可能隐患：运输包装、内盒或试剂盒损伤、单包装内存在混杂物质，标签错误缺失模糊，泄露，不适宜的存放条件等等。 开展条件：确认实验室-中国CDC能力验证，筛查实验室或筛查点-省级或市级能力验证。,质量保证,人员培训： 详细了上岗培训的内容 至少应包括艾滋病相关基础知识，艾滋病相关检测技术及管理要求，实验操作，质量保证和控制，生物安全 明确了培训类别：上岗培训和在岗培训 明确了培训的频度：复训，确证实验室每年至少一次，筛查实验室人员至少2年一次。 增加了CD4和HIV病毒载量检测的质量管理,质量保证,标准操作程序(SOP) 各级艾滋病实验室要建立覆盖主要工作内容的SOP文件应包括： 1、样品的接收、登记、处理、保存和运输 2、检测方法和步骤 3、试剂使用和保存 4、仪器的使用维护和校准 5、质量控制要求及程序,质量保证,标准操作程序(SOP) 6、结果解释与报告 7、保密程序 8、实验室数据、相关文件记录与保存 9、不确定样品追踪和处理 10、实验室安全防护及实验室的清理和消毒 SOP应有标题和编号、编写和修订日期和人员姓名以及各类相关的表格等信息。,质量保证,实验原始记录表 应按实验要求，设计实验操作原始记录表，标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置，便于指导实验人员加样。同时应注明试剂厂家、测定方法、批号、效期、实验室环境温湿度、操作人员和复核人员姓名及检测日期。,质量评价,内部质量评价 外部质量评价,内部质量评价,本实验室组织的质量评价，应定期组织，应包括样品接受、检测、包存至发出报告的各个环节。 确证中心实验室应通过实验室认证认可，鼓励确证实验室或筛查实验室通过认可，或按照认可的有关条款建立质量评价机制,外部质量评价,职能工作考核：评价实验室质量保证 明确了现场抽查的百分比510% 列出了问卷调查的内容：省级考核至少应包括人员培训及能力，环境条件，仪器设备使用及校准，管理型文件及试验记录，检测报告，试剂使用情况，样品接受及保存情况，质量保证和质量控制。 能力验证：评价实验室质量控制工作，检验实验室对未知样品获得正确结果的能力,HIV诊断试剂临床质量评估,通过对国内销售的国产和进口HIV诊断试剂的敏感性、特异性、批间差异和适用性进行综合质量评估，及时发现和解决试剂质量问题，为中央和地方卫生行政部门提供有关的决策依据，并作为艾滋病实验室选择试剂的依据，未参加评估的试剂一般不推荐使用。 评估结果在中国CDC性病艾滋病预防控制中心网页上公布。/,2014年全国艾滋病病毒（HIV）抗体诊断试剂临床质量评估结果,从国内市场上随机抽取了41种HIV抗体筛查试剂，根据检测标志物和原理将试剂分为3类分别进行了评价。主要结果： （1）HIV抗体检测酶联、化学发光和免疫荧光试剂13种，敏感性、特异性和功效率分别为99.40100%、94.41100%和96.47100%； （2）HIV抗原抗体检测酶联和化学发光试剂9种，敏感性、特异性和功效率分别为99.36100%、92.66100%和95.02100%； （3）HIV抗体或抗原抗体快速检测试剂19种，敏感性、特异性和功效率分别为100%、95.10100%和96.90100%。,第六部分 实验室生物安全,HIV的生物危害,增加了HIV的生物危害分类：第一、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物， HIV属于第二类病原微生物，是高致病性微生物。,HIV相关检测的生物安全级别,增加了HIV毒株保存级别：符合III级生物安全的艾滋病检测实验室 增加了阳性样品的保存级别：全血、血清、血浆和其它组织液、核酸提取物，符合II级生物安全级别的实验室。,生物安全保证措施：,编排更合逻辑，更具有操作性 建立安全制度：列出了安全制度目录 1.实验室的安全工作制度或安全标准操作程序 2.意外处理预案 3.信息安全和保密制度 培训和管理 安全操作 使用利器注意事项,1 个人防护,1.1 艾滋病实验室应配备一次性手套、一次性口罩、安全防护眼镜及冲洗眼睛的装置。 1.2 艾滋病实验室应配备实验室专用的工作鞋，鞋面覆盖足背，鞋底防滑。 1.3 个人保健 1.3.1 高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。皮肤受损、患病都会增加感染的危险。皮肤的任何伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖。,1 个人防护,1.3.2 进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。 1.3.3 进入实验室应穿隔离衣，戴手套。如果接触物传染危险性大，则应戴双层手套和防护眼镜。 1.3.4 离开实验室前必须脱去隔离衣，并洗手。 1.3.5 严禁在艾滋病实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。,2 实验室的安全操作,2.1 在安排工作人员的实验室区域时，要根据其工作的种类和所涉及的生物试剂，对实验室环境做好安全检查。 2.2 进入实验室应穿隔离衣、戴手套，必要时（如对初筛阳性标本进行复测或确认时，或直接对HIV毒种进行操作时）戴防护眼镜，以防污染