功能显像与靶区勾画ppt课件

血清蛋白质组学技术筛选NSCLC放化疗敏感性标志物,山东省肿瘤医院放疗科 黄伟 丁秀平 李宝生,第一部分,放化疗敏感性血清标志蛋白的筛选,蛋白质组学与预测标记物,放化疗敏感性的变化不是某一个蛋白发生变化所致，而是组织或细胞内大量蛋白质所形成的复杂网络变化所致，是各因素相互作用引起的。 蛋白质组学(proteomics) 是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律，实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析。,1. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 2.电喷雾电离串联质谱 3.表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱,其原理是先进行等电聚焦，蛋白质沿PH梯度分离，到达各自的等电点，随后按分子量把复杂的蛋白质成分分离,巨量生物信息资源的收集、存储、处理、共享、研究和开发。由数据库、计算机网络和应用软件3大部分组成,蛋白组学技术流程,双向凝胶电泳 (2-DE),质谱技术 (MS),生物信息 技术,质谱技术,基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）：利用基质吸收激光的能量使固相的多肽样品离子化，获得蛋白质的肤质量指纹图（PMF），然后通过相应的数据库搜索，鉴定蛋白质； 电喷雾质谱（ESI-MS）：在喷射过程中以连续离子化方式使多样品电离； 表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）:蛋白芯片技术。 串联质谱（MS/MS）：用于肤段的氨基酸测序；液相色谱-质谱联用（LC MS/MS）,LC-MS/MS联用的优点,因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析 LC-MS/ MS没有偏向性，自动化程度高、可重复性好，为发现新的与疾病相关的血清蛋白标记物奠定了基础。,患者资料,16例患者放疗期间给予同步含顺铂双药方案化疗2周期 16例肺癌（腺癌或鳞癌）病人放化疗前的血清 RECIST 评价疗效，分为治疗敏感组和抗拒组，各8例患者，根据病理类型、年龄、性别、化疗方案进行一一配对,*放疗：40Gy后复位行后程加速超分割 ，1.4Gy，bid，至总量 59.6-73.6Gy *化疗：含铂类两药联合同步化疗2周期,患者详细临床资料,蛋白处理,血清收集,去除高丰度蛋白（Aurum Serum Protein Kit）,蛋白提取,蛋白定量 （Bradford 法）,2-DE,用IPGphor IEF System进行一相等电聚焦,将聚焦后的胶条在SDS平衡液中平衡两次,取出胶条在PROTEN II xi Cell上进行垂直SDS-PAGE第二相分离,分别取两个实验组混合血清各350l进行电泳，每组实验重复3次。,银染色方法,凝胶图象分析,用Umax PowerLook 1100透射扫描仪扫描凝胶，Imagemaster图像分析软件包对扫描图谱依次进行点检测、背景消减，建立平均凝胶，匹配、量化获取斑点的相关信息等分析 用两组血清蛋白质点数最多的敏感组胶图为参考胶，对六幅胶图进行虚拟重建，再利Imagemaster软件将两张胶图中的斑点进行匹配，匹配不上的斑点视为差异点，选取表达量差异2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点,质谱鉴定,考染 胶内酶解法酶解蛋白 nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱为分析柱 Synapt High Definition Mass Spectrometry质谱仪（Waters公司）进行质谱分析 SWISS- PROT蛋白质数据库,液相色谱-质谱（LC-MS）仪,nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱系统配备自动进样器,Synapt High Definition Mass Spectrometry 质谱仪,结果1.高丰度蛋白的去除效果,图1. 未去除高丰度蛋白的血清2-DE图谱,图2.去除高丰度蛋白后的血清2-DE图谱,结果2.2-DE图谱及图象分析,结果3.差异蛋白质斑点的鉴定,差异点为78个，根据3次2-DE结果，软件自动结合人工方式选取共同的蛋白质差异点8个进行质谱分析，其中在抗拒组上调的7个，抗拒组下调的1个,结果4. 血清蛋白质鉴定结果,结果5.鉴定蛋白质的功能分类,细胞凋亡,POTEE,TXLNG,APOA1、 A1AT,TMC5B、GFAP,转录和翻译,细胞结构蛋白,代谢,ApoA-I,载脂蛋白A1（ApoA-I） 是高密度脂蛋白( High-density lipoprotein，HDL) 的主要结构蛋白，是一种急性时相反应蛋白 2004年Zhang等报道前列腺癌患者血清载脂蛋白A-I浓度较正常对照者显著降低 程志强还报道骨转移的前列腺癌患者血清中ApoA-I的表达率显著低于无骨转移的患者 2008年刘桂芝等报道ApoA-I在人期肺癌组织及正常癌旁组织中具有差异表达。,1-AT,血清1-抗胰蛋白酶（1-AT） ,肝内和肝外合成，急性相蛋白，1-AT浓度在炎症，感染，肿瘤，肝病时均显著增加 研究发现多种恶性肿瘤细胞可以合成1-AT，并且组织局部的1-AT具有明显抑制肿瘤细胞生长、转移和实体瘤血管形成的特点。近年来，1-AT开始作为肿瘤的标记物协助诊断肿瘤和监测预后，但缺乏特异性。 黄立军，1-AT可能与非小细胞肺癌分化程度呈正相关，与肿瘤大小及临床分期呈负相关，即恶性程度愈高、临床分期愈差，1-AT表达水平越低。因此，检测1-AT表达可能是用于判断肺癌恶性程度的有价值指标之一。 研究证实肺癌及非癌性疾病组血清1-AT水平均显著高于正常对照组，肺癌且明显高于非癌性肺病组。,蛋 白 验 证,第二部分,研究方法,入组标准：初治、III期、NSCLC 共50例患者 实验方法：酶联免疫吸附试验（ELISA） 统计方法： *单因素方差分析（one-way ANOVA） *独立样本t检验 *受试者工作特征（ROC）曲线,入组患者资料,疗效评价： 敏感组37例-CR 10例，PR 27例 抗拒组13例-SD 9例，PD 4例,研究结果,一.不同亚组ApoA-1和1-AT比较（one-way ANOVA）,注：各亚组之间样本均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），粗体数值表示具有统计学意义,研究结果,二. 放疗前、中、后ApoA-1和1-AT组间比较,研究结果,三. ApoA-1在全组、敏感组、抗拒组 于放疗前、中、后平均浓度柱状图,研究结果,三. 1-AT在全组、敏感组、抗拒组 于放疗前、中、后平均浓度柱状图,研究结果,四.放疗前1-AT对放化疗抗拒者预测能力,研究结果,四、Post/Pre1-AT对放化疗敏感者预测能力,研究结论,1-AT与NSCLC的肿瘤分期及病理类型有关 治疗前1-AT敏感组水平明显低于抗拒组，治疗前患者1-AT基础水平能预测NSCLC放化疗敏感性