细胞凋亡及其检测方法.ppt

细胞凋亡及其检测方法,1885年 Flemming退行性卵泡上皮细胞的染色质聚集成半月状或固缩成小体状； 1886年 Nissen在哺乳期乳腺中观察到类似改变；,1949年 Hamberger鸡胚背根神经节早期发育 阶段有大量的细胞死亡；,1972年 Kerr生理条件下的细胞死亡，有其特征 性的表现；,Sydney Brenner 西德尼布伦纳,John Sulston 约翰 E苏尔斯顿,H.Robert Horvitz H.罗伯特霍维茨,研究细胞凋亡的意义,有助于理解健康与疾病、生命与死亡 ； 有助于理解一些病毒和细菌侵袭人体细胞的机理 ；（神经变性性疾病、中风、心肌梗塞和自身免疫疾病 ） 有助于疾病的防治激活或抑制细胞“自杀程序” ； 控制细胞凋亡的信号通道的正常与异常机理,重大挑战,王晓东教授主要研究成果集中在对于哺乳动物细胞凋亡的生化调控机制和信号通路的研究。2004年4 月21 日当选为美国科学院最年轻的院士。,教学目的 1、掌握细胞凋亡的特征。 2、通过对细胞凋亡检测方法的学习，能结合本专业完成研究细胞凋亡的实验设计。,细胞凋亡的定义,细胞凋亡(Apoptosis)是指在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，启动一系列死亡基因的表达，引起内源性核酸内切酶和蛋白裂解酶的合成，导致DNA裂解乃至细胞的主动死亡。 细胞程序性死亡（Programmed Cell Death PCD）,细胞凋亡的诱因 1,细胞凋亡的抑制因素,细胞凋亡的特征性变化 形态学,核的变化-染色质凝聚，核碎片形成,(续)形态学变化,胞质的变化 胞质浓缩（70%） 细胞器的变化 线粒体（变化不明显；个别线粒体增大、增殖、空泡化） 内质网（网腔扩大、提供包裹膜） 细胞骨架（肌球蛋白、肌凝蛋白表达下调） 细胞膜的变化 Zeiosis（泡化） 生物大分子丢失 新出现生物大分子（phosphatidyl serine） 凋亡小体的形成（Apoptosis Body） 凋亡过程中，核膜逐渐曲折变形、核仁裂解，随后胞膜内陷，整个细胞被分割为数个大小不等的有膜包裹的、内涵物不外泻的不连续小体，其内部可有一部分细胞器及核，该小体叫做凋亡小体。,细胞凋亡的特征性变化生物化学,（一）DNA Ladder 最突出的生化改变是染色质DNA的有控裂解。细胞发生凋亡时，细胞核内DNase、DNase在核小体间将染色质切为180-200bp或其整数倍的寡核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳分离裂解后的DNA图谱呈梯状，即梯状DNA。细胞坏死时DNA 随意裂解为长度不一的片断，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状(smear)”.,细胞凋亡的特征性变化生物化学,（二）多种蛋白酶的产生 caspase蛋白酶 （特异性酶切天冬氨酸氨基位点的半胱氨酸蛋白酶 Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase） 均以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中; 都具有相似的催化部位，包括一个含有活性位点Cys残基的保守的QACRG基元和一个含His残基的SHG基元; 具有自身活化和/或相互激活的能力; 粒酶（granzyme）-免疫细胞释放的丝氨酸蛋白酶 Calpain;,细胞凋亡的特征性变化生物化学,（三）胞浆Ca2+的变化 1、胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流促使胞浆Ca2+持续升高以信号转导方式、激活蛋白酶方式、激活核酸内切酶方式、激活转谷氨酰胺酶（transglutaminase）方式启动细胞凋亡； 2、Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分与细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。,（四）胞浆pH值的变化 1、胞浆酸化主要通过激活酸性DNase启动细胞凋亡； 2、pHi降低也增强了一些酸性蛋白质功能，如转谷氨酰胺酶、酸性鞘磷脂酶； 3、减弱细胞的呼吸爆发作用，生成与细胞凋亡相关的活性氧（reactive oxygen species,ROS）。 4、胞浆碱化可激活碱性核酸内切酶启动细胞凋亡。,细胞凋亡时线粒体的变化,1、细胞凋亡时，线粒体呼吸链受损，使细胞 生成ATP减少，导致细胞死亡； 2、线粒体产生的ROS增多，促进了细胞凋亡； 3、线粒体膜电位受损影响其功能，导致细胞 凋亡； 4、线粒体渗透性转换孔（mtPTP）开放。,细胞凋亡与坏死的区别,细胞凋亡的基本过程,信号始动阶段： 细胞膜表面特定受体可识别细胞死亡的胞外信号 并激活第二信使、激酶，始动凋亡； 凋亡信号的传导： P53、FADD、TRADD等介导凋亡信号的传导； 调控阶段： 由Bcl-2蛋白家族、细胞色素C及Caspase蛋白酶三 个效应器参与调控； 细胞凋亡的执行阶段： 细胞结构发生改变，呈现细胞凋亡形态学变化。,细胞凋亡信号转导分子,1、Fas/FasL系统，TNF/ TNFR系统； 2、 FADD（Fas-associating protein with death domain）， TRADD （TNFR1-associated death domain protein）； 3、 Bcl-2蛋白家族； 4、细胞色素C及Caspase蛋白酶； 5、 P53,Bcl-2家族,(apoptosis inducing factor),Bcl-2抑制凋亡的可能机制,抑制细胞质膜脂质过氧化物的形成，从而阻止氧化应激导致的细胞凋亡。 调节线粒体通透性。降低由凋亡因子诱导的线粒体膜通透性的增加； 增加线粒体摄取Ca2+的作用，提高线粒体对Ca2+诱导呼吸链损伤的耐受力。 抑制线粒体释放细胞色素C。 抑制Caspase-3蛋白酶的活化。,IAP Inhibitor of apoptosis Proteins,神经细胞凋亡的研究模型,1、从胚胎发育第21天大鼠分离获得交感神经元， 在外与NGF持续共同培养7d，然后加入抗NGF抗 体，封闭NGF； 2、去神经营养因子诱导神经细胞凋亡 ； 3、去血清诱导细胞凋亡； 4、低氧神经元凋亡模型； 5、低钾神经元凋亡模型; 6、各种凋亡诱导剂诱导的体内凋亡模型； 7、副交感神经元、运动神经元去轴突凋亡模型。,Morphological Changes of Astrocytes under Ischemia,: 0 hr,: 2 hr,: 4 hr,: 6 hr,: 8 hr,神经细胞凋亡的检测方法,根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征进行检测以及利用流式细胞仪进行检测。形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法，主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色。,研究方法的分类,一、根据方法的定性和定量特性分类 (一)只能定性的方法 常规琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）。 (二)能进行定量或半定量的方法 各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA、定量琼脂糖凝胶电泳。,（续）研究方法的选择,二、根据是否能将凋亡和坏死区分开 1、不能将凋亡和坏死区分开 原位末端标记法，PI单染色法 等。 2、将凋亡和坏死区分开 琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（特别是透射电镜是区别凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，Annexin V/PI双染色法流式细胞仪检测等。,三、根据样本来源不同选用不同的方法 1、组织 对活检组织或手术标本主要用形态学的 方法如HE染色，透射电镜，还可以进行石蜡 包埋组织切片行原位末端标记。也可作ELISA 和将组织碾碎消化作琼脂糖凝胶电泳。 2、培养细胞 对细胞株或原代培养的细胞几乎所 有的方法都可用。,（续）研究方法的选择,细胞凋亡的检测方法,普通光学显微镜观察方法 透射电子显微镜观察方法 荧光显微镜观察方法 琼脂糖凝胶电泳 原位末端标记技术 流式细胞仪染色法,(Electron Micrograph),Astrocytes under Ischemia,早期：核染色体发生边集、固缩，电子密度增强，核形不规整，核膜表面凹凸不平； 核发生碎裂，在细胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片；细胞体积变小，胞浆浓缩，空泡增多； 晚期：可见膜包裹的内有较完整的细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。,常规琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder,检测细胞凋亡时染色体从核小体间裂断形成由大约为 180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。提取DNA片段，UV灯下观察可见特征性的“梯状(ladder)”带。 缺点:敏感性不高，且不能定量,常规步骤,收集细胞，PBS漂洗1次，2000r/min离心5min，弃上清。 在1.5ml微量离心管中，离心收集细胞，弃上清。 加入TE缓冲液400l，悬浮细胞；缓漫加入1%SDS溶液20l，摇匀。 加入RNase(200g/ml)42l混匀，终浓度为20ug/ml，37，60min。 加蛋白酶K溶液21l至终浓度为100g/ml，混匀，于50温育3h。 冷却至室温，然后加入等体积的饱和酚抽提DNA，混匀后10,000r/min离心10min。 吸取上清至另一EP管，加1/2体积氯仿：异戊醇抽提，混匀后10,000r/min离心10min。 取上清至另一EP管，加等体积氯仿：异戊醇再抽提一次，10,000r/min离心10min. 取上清至另一EP管，加1/10体积的5mol/L乙酸钾和2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，可见絮状白色沉淀物，置于-20沉淀过夜。 12,000r/min离心10min沉淀DNA，弃上清，加1ml 75%乙醇洗沉淀的DNA，12,000r/min离心10min，充去上清液。 置室温待乙醇挥发尽之后，加20lTE缓冲液轻轻摇动溶解。 取20l样本，加4l上样缓冲液，立即加到含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶的样品孔中，于1TAE缓冲液中电泳(电压60V)1.5-2h，紫外透照仪下观察结果，拍照存档。,琼脂糖凝胶电泳的定量检测,将放射性同位素32P标记在经提取的寡小体片段5末端，用X光片通过放射自显影成象，并用特定的设备分析计算进行定量研究。 优点:灵敏度极高，是常规琼脂糖凝胶电泳的1000-2000倍；能定量；,常规步骤,(1)DNA提取同常规琼脂糖凝胶电泳法。 (2)在0.5ml Eppondorf管中加入下列反应体系： 细胞DNA 0.5-1.0g 10缓冲液 2l 32P-dATP（或32P-dCTP） 0.5Ci Klenow聚合酶 5U 双蒸水加至 20l (3)混匀后10000r/min离心数秒，置室温中反应30min。 (4)加入1l 0.5mol/L EDTA终止反应。 (5)常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，室温干燥。 (6)加入20l TE缓冲液溶解DNA。 (7)取标记DNA20l加上样缓冲液4l，混匀后加样于1.8%琼脂糖凝胶，50V 电泳约2h。 (8)电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进地放射自显影。,原位末端标记技术,原位末端标记(in situ end-labeling, ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。 催化酶 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) DNA聚合酶I,常用原位末端标记技术,1.末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling)，简称TUNEL； 2.DNA聚合酶I介导的原位缺口平移(in situ nick translation)简称ISNT。,常用的标记物和显示系统,生物素标记的dUTP(biotin-dUTP)，其相应的显示系统为卵白素（avidin）或链卵白素(streptavidin)标记的辣根过氧化物酶（HRP）和显色底物DAB； 地高辛(digoxigenin)标记的dUTP(digoxigenin-dUTP)，显示系统为辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(正常羊Fab片段)和DAB； 荧光素标记的dUTP（常用FITC-dUTP）,用流式细胞仪分析或在荧光显微镜下观察。,神经细胞凋亡的检测方法 -ISNT,基本原理细胞凋亡时产生DNA断链，利用DNA聚合酶 I 5-3聚合酶活性，可将外源掺入的带有生物素标记的游离核苷酸从3羟基末端起始经5-3方向连接在断端上，根据其携带的标志物选择适当的显色系统，观察细胞是否存在有核苷酸掺入的DNA断端。,缺口平移法,ISNT结果判断,采用Biotin-16-dUTP对石蜡组织切片凋亡细胞内DNA断裂片段的末端进行标记，凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。而正常非凋亡细胞和阴性对照片核被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致。,神经细胞凋亡的检测方法 -TUNEL,TUNEL所介导的酶是TdT，该酶能将外源性的生物素或地高辛标记的dUTP无需DNA模板连接到凋亡细胞核DNA断链的3-羟基(3-OH)末端，根据dUTP携带的标志物选择适当的显色系统原位显示DNA断端。,在目前常用试剂盒中，多用TdT酶催化DNA单链和双链3-OH末端非模板依赖性的Br-dUTP掺入反应。用荧光标记的BrdU抗体进行细胞染色后，用流式细胞仪来检测，即可得到细胞凋亡结果。 与其他标记物相比（荧光素、生物素或地高辛）， Br-dUTP更容易掺入凋亡细胞的基因组中。,(TUNEL Staining),Astrocytes under Ischemia,原位末端标记技术注意事项,对组织切片进行预处理是必要的，可以提高该方法的敏感性和消除假阳性及非特异性染色。预处理主要包括： 组织切片用2SSC加热，80共孵育20min； 内源酶阻断剂可消除由内源性过氧物酶引起的非特异性染色； 蛋白酶的消化，时间要得当； TdT 及DNA多聚酶I的浓度过高也可引起非特异性染色。,流式细胞仪 FLOW CYTOMETER,用流式细胞仪(flow cytometer)检测细胞时，必须用荧光染料对细胞进行染色，并要求细胞呈悬浮状态。 可将细胞分类作进一步的形态学和生化分析。 既可定性又可定量，且具有简单、快速和敏感性高等优点。,散射光信号,FS-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 ; FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性,如:大小 SS-Side (Angel Light) Scatter -与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器; SS用于检测细胞内部结构, 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 .,流式细胞仪检测凋亡细胞的原理,一、核的改变; 二、细胞膜的改变通透性增加； “活(viable)”细胞在不经固定的情况下对EB、PI或7-AAD等染料拒染； 三、光散射特性 四、线粒体跨膜电位 五、溶酶体质子泵 六、蛋白质和DNA含量,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 630 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670,用于流式细胞仪检测的荧光染料,Annexin V 检测细胞凋亡,Annexin V是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。 因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。,凋亡细胞的TUNEL流式细胞仪分析,固定细胞的染色方法 TUNEL在显色时用FITC标记链卵白素与Biotin结合，再结合PI染色就可以通过流式细胞仪检测凋亡细胞，这种方法不仅可以定量检测凋亡细胞，而且还可以显示凋亡细胞在细胞周期中所处的位置(G0/G1)。,常规步骤,1.离心收集细胞，PBS洗1或2次；1%多聚甲醛(PBS配制pH7.4)低温下固定15min； 2.3ml PBS洗1次，70%乙醇固定，-20放置1-3d； 3.PBS轻洗1次；细胞与50-100l的TdT标记液（含Biotin-dUTP ）37孵育，时间1-2h； 4.PBS轻洗1次；细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液（含 Avidin-FITC ）孵育30min； 5.含0.1% Triton-X 100的PBS轻洗1次； 6.1ml PBS(含5mg/ml PI, 0.1% Rnase A)重悬； 7.流式细胞仪分析红色(PI)(取线性值)对绿色荧光(FITC)(取对数值)的地形图。 结果判断： 1. 凋亡细胞与正常细胞相比，FITC染色明显增强； 2. PI染色反应用于指示细胞周期，对于有细胞周期特异性的apoptosis,可在地形图上相应的细胞周期（ PI染色反应）位置上方出现一群FITC的细胞群。,优 点,-