咪唑类药物致急性脱髓鞘脑病的药物流行病学研究课件

左旋咪唑诱发加重EAE 的实验研究通报 温州医学院附属第一医院 神经科 郑荣远 邢清和 韩 钊 李 勇 杨学志 朱振国 殷为勇 邱伟文 吴赛珍 卢晔芬 一、左旋咪唑对中枢免疫的作用？ 二、LMS对实验性变态反应性 脑脊髓炎(EAE)的影响? 二、LMS诱发加重EAE的作用机制? LMS能诱发人体的急性脱髓鞘性脑炎,推测 是引发了颅内B型药物不良反应的型变态 反应; 急性脱髓鞘性脑炎的动物模型? 公认是EAE -T细胞介导的迟发性自身免疫反应性脑脊 髓炎! EAE能模拟人类急性脱髓鞘性脑炎 行为学改变 组织病理学改变 炎症细胞浸润 神经髓鞘脱失 分子病理学改变 CD4+/CD8+分子水平 TH1/TH2分子水平 促炎细胞因子、抑炎细胞因子表达水平 LMS能否诱发加重实验性变态反应 性脑脊髓炎(EAE)? LMS对EAE的影响是直接的?还是间接的? LMS是在怎么样的条件下才能够起作用的? LMS通过体内哪些免疫反应环节?何种途径 ?何种蛋白? 而发生作用的? 学术探索-艰辛之旅-漫长畸曲之路,阳光灿 烂之道! 动物试验建立LMS诱发加重 急性脱髓鞘性脑炎的动物模型 1、Wistar大鼠实验性过敏性脑脊髓炎（ experimental allergic encephalomyelitis, EAE）动物模型，来研究LMS对急性炎性脱髓 鞘脑病作用及其机制; 2、Lewys大鼠EAE动物模型，来研究LMS对 急性脱髓鞘性脑炎(脑病)的作用及其机制; 3、C57/BL小鼠EAE模型，来研究LMS对中枢 急性炎性脱髓鞘性脑病的作用及其机制; LMS能否诱发加重实验性变态反应 性脑脊髓炎EAE? A、用LMS不同剂量、不同给药方法，直 接或间接地诱发Wistar大鼠EAE，观察其发 病率、神经症状、病理改变、复发等影响 实验结果一：LMS对EAE有明显的 促发（加重）作用： 1）LMS可明显提高EAE的发病率，加重其神经症 状，促进EAE的复发。 2）LMS对EAE影响的量效关系呈“钟型”，以 10mg/kg的LMS作用最强，在发病率、病理表现 、炎性细胞因子等变化均如此。 3）LMS对能明显上调EAE中枢ICAM-1、iNOS、 IFN、IL-1、IL-2、IL-6 mRNA表达。 LMS对不同免疫方法诱发EAE的影响: 提高发病率、加重神经症状、促进复发 LMS对GPSCH组和GPSCH+BPV组两种方 法诱发的EAE均有促发-加重作用： LMS可增加EAE的发病率，加重临床症状 LMS对两者的影响程度明显不同： LMS对GPSCH组的促发作用更为明显。 1、邢清和，郑荣远。复旦学报医学科学版，2001，28(3): 202-205。 2、邢清和，郑荣远。中国免疫学杂志，2002， 18(6): 420-421。 LMS提高EAE的发病率 GPSCH：豚鼠全脊髓匀浆； LMS：左旋咪唑，抗原乳剂免疫后0、24、48h 3次ip； BPV:百日咳疫苗，抗原免疫后即刻后肢ic； dpi:免疫后天数； a P0.05, b P0.05, c P0.01与GPSCH组相比；d P0.05, 与GPSCH+BPV组相比。 表1 左旋咪唑对唑对 不同方法诱发诱发 EAE的影响 组组组组 别别别别 n n 潜伏期潜伏期(dpi) (dpi) 发发发发病率病率 Control 10 - 0/10Control 10 - 0/10 GPSCH 10 13.81.26 4/10 GPSCH 10 13.81.26 4/10 GPSCH+LMS 10 13.61.01 GPSCH+LMS 10 13.61.01 a a 9/10 9/10 b b GPSCH+BPV 10 11.81.20 GPSCH+BPV 10 11.81.20 b b 9/10 9/10 b b GPSCH+BPV+LMS 10 12.01.41 GPSCH+BPV+LMS 10 12.01.41b,d b,d 10/10 10/10c,d c,d LMS加重EAE的神经症状 *为发病动物EAE症状评分的均值；GPSCH：豚鼠全脊髓匀浆；LMS： 左旋咪唑；BPV:百日咳疫苗，抗原免疫后即刻后肢ic；dpi:免疫后天 数；a P0.05, b P0.05, 与GPSCH组相比；d P0.05, e P0.05 与GPSCH+BPV组相比。 表表2 2 左旋咪左旋咪唑对唑对唑对唑对 不同方法不同方法诱发诱发诱发诱发 的的EAEEAE症状症状评评评评分的影响分的影响 ( (症状症状评评评评分分标标标标准差准差)*)* 组组组组 别别别别 发发发发病病动动动动物数物数 14dpi 16dpi 14dpi 16dpi Control - - -Control - - - GPSCH 4 1.671.15 2.501.29 GPSCH 4 1.671.15 2.501.29 GPSCH+LMS 9 2.121.25 GPSCH+LMS 9 2.121.25 a a 3.001.323.001.32 a a GPSCH+BPV 9 2.881.20 GPSCH+BPV 9 2.881.20 a a 2.781.09 2.781.09 a a GPSCH+BPV+LMS 10 3.331.00 GPSCH+BPV+LMS 10 3.331.00b,d b,d 2.901.292.901.29a,d a,d 图2.LMS对EAE症状评分影响的动态观察 （）Control, () GPSCH, () GPSCH+LMS, () GPSCH+BPV, () GPSCH+BPV +LMS. N=10. 照片三. LMS促发EAE的CNS病理变化 照片四. LMS促发EAE的CNS病理变化 LMS不同给药方法对EAE的影响 单次给药、3次给药对EAE均有促发作用： EAE发病率增加，症状加重趋势，潜伏期 无明显影响 不同方法给药，影响程度明显不同： 3次给药对EAE促发作用更为明显。 表3. 左旋咪唑不同给药方法对EAE影响 dpi:免疫后天数； a P0.05, b P0.05, 与EAE组相比；LMS：左旋咪唑； 抗原乳剂免疫后即刻1次ip LMS 10mg.kg-1； *抗原乳剂免疫后0、24、48h 3次ip LMS 10mg.kg-1。 组组组组 别别别别 n n 潜伏期潜伏期(dpi) (dpi) 发发发发病率病率 Control 10 Control 10 0/100/10 EAE 10 13.81.26 4/10 EAE 10 13.81.26 4/10 EAE+LMS*1 EAE+LMS*1 * * 10 13.31.21 10 13.31.21 a a 6/10 6/10 a a EAE+LMS*3 EAE+LMS*3* * 10 13.61.01 10 13.61.01 a a 9/10 9/10 b b 表4. 左旋咪唑不同给药方法对EAE症状评分影响 (症状评分标准差)* * 为发病动物EAE症状评分的均值； LMS：左旋咪唑； *抗原乳剂免疫后即刻1次ip LMS 10mg.kg-1； *抗原乳剂免疫后0、24、48h 3次ip LMS 10mg.kg-1。 dpi:免疫后天数；a P0.05, 与EAE组相比。 组组 别别 发发病病动动物数物数 14dpi 16dpi 14dpi 16dpi Control Control EAE 4 1.671.15 2.501.29EAE 4 1.671.15 2.501.29 EAE+LMS*1 EAE+LMS*1 * * 6 2.201.30 6 2.201.30 a a 2.671.21 2.671.21 a a EAE+LMS*3 EAE+LMS*3* * 9 2.131.25 9 2.131.25 a a 3.001.32 3.001.32a a 图4. LMS不同给药方法对EAE症状分值影响的动态观察 （）Control, () GPSCH, () GPSCH+LMS*1, () GPSCH+LMS*3, N=10. 图3. LMS不同给药方法对EAE体重的影响 （ ）Control, () GPSCH, (Control, () GPSCH, ( ) GPSCH+LMS*1, () GPSCH+LMS*3, N=10.) GPSCH+LMS*1, () GPSCH+LMS*3, N=10. LMS对EAE复发的影响 LMS不仅增加EAE发病率，还促进EAE复发 表5. 左旋咪唑对唑对 EAE复发发的影响 组组组组 别别别别 n n 潜伏期潜伏期 * * 发发发发病率病率 复复 发时间发时间发时间发时间 * * 复复发发发发率率 Control 8 Control 8 0/8 0/8 EAE 8 13.51.29 4/8 EAE 8 13.51.29 4/8 0/40/4 EAE+LMS10 8 13.91.07 7/8 EAE+LMS10 8 13.91.07 7/8 24.03.21 3/724.03.21 3/7 EAE+LMS30 8 14.30.82 6/8 EAE+LMS30 8 14.30.82 6/8 27.51.41 2/627.51.41 2/6 * 免疫后天数；LMS：左旋咪唑，抗原乳剂免疫后0、24、48h 3次ip. 图5. LMS对EAE复发的影响 （）Control, () EAE, () EAE+LMS10, () EAE+LMS30. N=8. 重复实验结果表明：LMS能诱发动物的中枢免疫 变态反应过程，诱发急性脱髓鞘性脑病（脑炎） 。相关的动物模型能复制。 以上表明LMS能： 增加EAE的发病率，加重EAE的临床症状，并促 进EAE的复发，对EAE有明显的促发作用。 LMS 3次给药的促发作用强于单次给药， 剂量为10mg.kg-1作用最强，这与LMS增强免疫 时的量效关系是一致的； 单独应用LMS制成的乳剂来免疫Wistar大鼠，亦 表现出与EAE大鼠相似的临床症状与病理学改变 ，随后的研究亦证实了这一点，如图6、图7和表 6、表7 实验结果二：LMS对EAE有 （直接）激发作用： LMS能直接激发EAE： 经过两届研究生的重复试验，用LMS（替代豚鼠 脊髓匀浆）制作抗原乳剂，也同样能激发EAE，行 为学和组织病理学改变与经典的EAE相同。 4、李 勇，李剑敏，郑荣远，等. 温州医学院学报。2003,33(2):82-84。 5.杨学志，郑荣远，李剑敏，等. 中国临床神经科学.2005,13(4):343-347 LMS能直接激发EAE： 图6 所示：随着疾病的不断进展，动物逐渐出现活动减少、食欲下降、 体重减轻，症状达到高峰时，体重下降达到最低点。 表6. 不同抗原组别诱发EAE的发病情况 Dpi: 免疫后天数，分别与GPSCH组的潜伏期和发病率相比: ap = 0.525 0.05； bp = 0.049 0.05； dp = 0.024 0.05 GroupGroup n n LatencyLatency（dpidpi）Incidence Incidence raterate ControlControl1010 GPSCH-EAEGPSCH-EAE202013.38 0.9213.38 0.929/20(45%)9/20(45%) LMS-EAELMS-EAE202013.75 0.9613.75 0.96 a a 4/20(20%)4/20(20%) c c LMS+GPSCH-EAELMS+GPSCH-EAE232312.13 1.3612.13 1.36 b b 18/23(78.26%)18/23(78.26%) d d EAE动物的神经症状观察(评分法) 图7所示：于抗原免疫后10天左右，相继出现尾巴无力、松弛、下垂， 步履蹒跚，后肢无力、瘫痪、四肢麻痹等典型症状， 与GPSCH组相比，LMS+GPSCH组潜伏期明显缩短。 LMS激发EAE的组织病理学改变 照片五. LMS激发 EAE , CNS明显炎性反应( 血管套) -HE染色200） 照片六. LMS激发 EAE，CNS明显炎性反应和 脱髓鞘，（LFB染色200，斑片状脱髓鞘） 照片七. LMS激发EAE,CNS明显炎性反应和 脱髓鞘（LFB染色400，片状髓鞘稀疏） LMS的中枢免疫药理作用机制？ LMS 通常已知的CNS免疫反应过程 有哪些影响呢？ CD4+T细胞 Th1细胞Th2细胞Th3细胞 IL-2 TNF- IFN- IL-4 IL-10 TGF- EAE相关的细胞因子网络 TNF-,IFN- 诱发和加重 EAE的发展 IL-23 IL-4,IL-10 促进EAE的 缓解和恢复 TGF- IL-17 IL-12 TH1细胞 THIL-17THIL-17细胞细胞 TH2TH2细胞细胞 TH3TH3细胞细胞 实验结果三、LMS促发加重EAE的 免疫分子病理表现 进行了有关免疫细胞、蛋白、分子水平的观察，结果表明 ： LMS对加重EAE大鼠CNS血脑屏障的影响 MMP-2 、ICAM-1表达增加。 LMS增加EAE神经系统CD4阳性细胞数，同时激活了 B27-CD28共刺激信号通路的分子表达。 LMS促进EAE的ICAM-1、iNOS及IFN、 IL-1、IL-1和 IL-2mRNA表达的升高。 LMS促进EAE大鼠脊髓内ICAM-1及IFNmRNA 的表达。 6.杨学志，郑荣远，李剑敏，等.温州医学院学报.2005,35(6):443-445 11. 李勇, 郑荣远, 李剑敏,等. 中国神经科学杂志,2004,20(05):384-387. LMS对EAE大鼠脊髓内 CD28和CD4表达的影响-增加 与第3组比较，p0.01, p0.05 表2 EAE大鼠CD28 CD4及CD8变化 groupgroupn n CD28CD28 CD4CD4 CD8CD8 LMSLMS同时给药组同时给药组 9 9 16.25.2016.25.20 32.432.47.267.26 2.42.40.520.52 LMSLMS预处理组预处理组 9 9 11.811.83.493.49 32.832.86.156.15 2.52.50.580.58 EAEEAE组组 6 6 6.56.50.700.70 16.016.02.862.862.22.20.660.66 LMS对EAE大鼠脊髓内 B7-1和B7-2表达的影响 与第3组比较，p0.01 表2 EAE大鼠B7-1、B7-2表达水平情况 group n B7-1 B7-2 LMSLMS同时给药组同时给药组 105.001.02 8.291.73 LMSLMS预处理组预处理组95.460.77 8.840.90 EAEEAE组组62.240.14 3.930.51 图1 EAE发病过程中的症状评分变化 Mean Clinical Score为每组所有动物EAE症状评分的均值 LMS对EAE脊髓内 IFN-、TGF-1 mRNA表达的影响 各组IFN-、TGF- mRNA表达水平与临床指标变化 /病理变化程度之间具有相关性 表5 LMS对EAE大鼠脊髓IFN-、TGF- mRNA表达的影响 CFA对对照组组EAE组组LMS1组组LMS2组组LMS3组组 IFN-0.1090.180*0.6730.4290.8210.4061.1290.168*0.8250.417 TGF-0.2070.409*1.5450.3431.1990.1011.0140.168*1.4780.079 吴赛珍，郑荣远，邱伟文，等。中国临床神经科学杂志，2006（6） 表4-2. LMS对EAE大鼠脊髓内 IL-1和IL-1 mRNA表达的影响 a P0.05, b P0.05, c P0.01与Control组相比; d P0.05, e P0.05, f P0.01与EAE组相比. 组组 别别 n IL-1 IL-1 (IL-1/-actin) (IL-1/-actin) Control 8 0.1120.046 0.0480.051 EAE 10 0.2260.142b 0.2740.266b LMS+EAE 10 0.5210.322e 0.6050.399e 表4-3. LMS对EAE大鼠脊髓内 IL-2和IL-6 mRNA表达的影响 a P0.05, b P0.05, c P0.01与Control组相比; d P0.05, e P0.05, f P0.01与EAE组相比. 组组 别别 n IL-2 IL-6 (IL-2/-actin) (IL-6/-actin) Control 8 0.0850.046 0.0980.080 EAE 10 0.9540.724c 0.3630.239b LMS+EAE 10 1.8590.872e 0.4630.182d 表4-4 LMS对EAE大鼠脊髓内 ICAM-1和iNOS mRNA表达的影响 a P0.05, b P0.05, c P0.01与Control组相比; d P0.05, e P0.05, f P0.01与EAE组相比. 组组组组 别别别别 n ICAM-1 n ICAM-1 iNOSiNOS (ICAM-1/-actin) ( (ICAM-1/-actin) (iNOS/-actiniNOS/-actin) ) Control 8 0.7840.262 0.0640.038 Control 8 0.7840.262 0.0640.038 EAE 10 0.9480.421 EAE 10 0.9480.421 a a 0.8510.597 0.8510.597 c c LMS+EAE 10 1.2960.304 LMS+EAE 10 1.2960.304 e e 1.5340.917 1.5340.917d d 表4-5. LMS对EAE大鼠脊髓内 IFN mRNA表达的影响 a P0.05, b P0.05, c P0.01与Control组相比; d P0.05, e P0.05, f P0.01与EAE组相比. 组组组组 别别别别 n n IFNIFN (IL- (IL- 1/-actin) 1/-actin) Control 8 Control 8 0.0410.014 0.0410.014 EAE 10 EAE 10 1.4100.6331.4100.633 c c LMS+EAE 10 LMS+EAE 10 2.8831.2512.8831.251 f f LMS对EAE大鼠CNS血脑屏障的影响 MMP-2 、ICAM-1表达增加 LMS1与EAE组相比P0.05 LMS2与EAE组相比P0.01 表4 各组大鼠大脑MMP-2 、ICAM-1 mRNA阳性细胞数(个/ 视野) 的变化(x s) groups MMP-2 ICAM-1 CFA对对照组组 EAE组组 10.661.52 10.331.15 LMS1组组 18.802.282 14.002.001 LMS2组组 17.252.912 14.372.442 LMS3