基因突变致家族性扩张型心肌病

LMNA基因突变致家族性扩张 型心肌病 中山二院心内科 王景峰 袁沃亮 前言 n家族性扩张型心肌病（familial dilated cardiomyopathy，FDC)，定义为至少有2个有 紧密血缘关系的家庭成员有DCM 。 nFDC的病例在逐步增加，目前占DCM的比例 约为20-50。 Burkett EL, Hershberger RE. Clinical and genetic issues in familial dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2005;45:969-81 前言FDC的遗传方式 n常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)，目前 至少16个基因被发现可引起FDC； 占FDC90以上 nX染色体伴性遗传（X-linked ）：主要见于 DMD/BMD(肌营养不良)； n常染色体隐性遗传(autosomal recessive，AR)：很少 n最常见的是编码-肌球蛋白重链的MYH7基因以及编 码 lamin A/C蛋白的LMNA基因 前 言 2005年3月发现一名扩张型心肌病合并心房纤颤及度房室 传导阻滞的患者，其伴有肢带型肌营养不良（LGMD）； 家族中有多名类似的肌病患者，合并心脏损害， 是一个家族 性扩张型心肌病的家系。 展开家系调查；并以LMNA基因作为候选基因进行突变的筛 选检测，以阐述其分子遗传学机制。 资料与方法： n该家系共30人 n4代共9名患者，目前存活的患者共5人，病史在 1538年间。 n临床表现：缓慢进展的四肢无力、肌肉萎缩、肌张力 减退，以肩带及盆带部明显，走路呈“鸭步”，无腓肠 肌假性肥大。 实验方法 n血清：心肌酶（谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、肌酸磷酸激 酶-同功酶MB、乳酸脱氢酶、乳酸脱氢酶-同功酶1）、C反 应蛋白及肌钙蛋白T。 n所有成员行心电图、超声心动图检查 n肌肉活检 ：4位患者及一个表型正常者 n病理学方法：苏木素-伊红染色（HE 染色）、免疫组化 Dystrophin染色 异常基因检测 n家系中患者临床特点符合LGMD-1B的表现。 n根据分子生物学的研究提示，LGMD-1B与位于1q21 上的核纤层蛋白LaminA/C编码基因突变相关。 n以核纤层蛋白LaminA/C作为候选基因作突变的筛选 ，以发现其遗传规律 材料和方法 n标本样品：家系所有成员抽取外周血置于EDTA抗凝管5ml2管， 混匀后置于-80冰箱中保存。 n正常对照取自中山大学遗传学教研室采集的正常志愿者血样本。 n外周血基因组DNA的提取：采用QIAamp DNA kit抽提DNA，按照 试剂盒附带的说明书进行。 nLMNA基因的聚合酶链扩增：对LMNA基因的全部12个外显子、外 显子-内含子交界区设计引物，进行聚合酶链（PCR）扩增。 PCR扩增 n反应体系：PCR Buffer3L、4种dNTP各20 mmol/L、 MgCl2 1.6 mmol/L，上游和下游引物各0.17 mol/L、Taq DNA聚合酶1.2 U，加ddH20至30L。 n扩增程序：反应条件为：94 预变性3 min； 94 变性 30 s、54退火45 s、72 延伸45 s、共35个循环；最 后72 延伸10 min。反应在Geneamp 9700 PCR仪上完 成。 测序 n程序：PCR产物经Excol 和SAP预反应，以去除多余的 引物和dNTP，然后以BigDye按标准程序进行正反双向测 序（982分钟，9610秒，505秒，604分钟，30 次循环；4恒温保存。） n产物经纯化以清除多余的原料和非特异性产物；最后在 ABI 3100测序仪上进行分析。 结果 系谱图：先证者为5。该家系共四代，目前存活的共30人 ，有27人参与了调查，其中男性14人，女性13人；年龄 0.572岁，平均年龄23.57.5岁。 临床特点 n所有患者均有四肢肌无力和肌萎缩，以肩胛带和骨盆带明 显，病程长者较病程短者萎缩更为明显；所有患者无关节 挛缩，无腓肠肌假性肥大。 n先证者为43岁男性 n患者有胸闷、心悸、活动后气促等病史一年余，经心电图 证实为心房颤动并房室传导阻滞、室性早搏；行心脏 彩超示心脏扩大。 n给予安置VVI起搏器。 临床特点 n先证者的大姐 （ 2） 和二姐（ 3）均有肌营养 不良病史，均已发生猝死，其中二姐在医院死亡时经 心电图证实为窦性停搏。 n11、15及1有心悸 患者51115 1 年龄（岁）43372822 肌萎缩是是是是 心肌酶无明显异常无明显异常无明显异常无明显异常 肌钙蛋白T正常正常正常正常 病理Dystrophin( +) Dystrophin(+)未做Dystrophin (弱+) 心电图房颤, AVB ，室早 AVB，房 早 快速房颤窦性心动 过速 超声心动图心脏增大心脏增大未见异常未见异常 表1 患者临床情况总结 表2 患者心肌酶及肌钙蛋白T结果 病人/项目511151正常值 AST（U/L） 28222420540 CK （U/L） 3223438327426306 LDH （U/L） 175160118195108252 CK-MB （U/L） 22251024024 LDH-1 （U/L） 595648701565 Hs-CRP （mg/L ） 1.040.444.400.2303.0 CTnT(ug/L) 0.080.060.10.080.010.1 表3 超声心动图结果 病人/项目511151 左房直径 (mm) 38332924 室间隔厚度 (mm) 9.97.07.07.0 左室后壁厚度 (mm) 9.37.67.66.5 左室舒张末径 (mm) 63.459.042.741.6 右房径(mm)45312626 右室径(mm)41352425 射血分数45556874 右图：11：度AVB 左图：5：房颤、起搏心律、室性早搏 15：快速房颤 1：窦性心动过速 正常对照HE染色（200） 肌营养不良HE染色（200）, 可见肌肉萎缩、肌裂、核内移 正常对照Dystrophin免疫组化染 色（）（200） 肌营养不良Dystrophin免疫组化染色 （） (200) 结果基因检查 n4名患者及一名表型正常的患者子女5（2岁，目前 无症状，为携带者）都存在着LMNA基因c.73CG （ g. Arg 25 Gly）突变，家系中所有的正常人以及正常 对照都没有该位点的突变。 讨论 家系病变特点总结： nFDC表现 n符合常染色体显性遗传 n临床及肌肉病理提示合并肌营养不良；Dystrophin(+)。 讨论 家系病变特点总结： n分子遗传学分析证实LaminA/C编码基因（LMNA）发 生了突变（c.73CG），第25号氨基酸由精氨酸突变 为甘氨酸（g. Arg 25 Gly） n该突变位点为国内首次报道。 LMNA基因及其突变 nLMNA基因及其编码蛋白 位于（1 q21.2q21 .3），基因组序列全长56 .7 kb，包含12个外显子。 LaminA/C的类型不同主要表 现为端球型“尾”部长短不同。 prelaminA(664a) laminA(646a) laminC(572a) LMNA基因突变 n引起肌肉、心脏、神经以及间质的异常 nLMNA基因突变是导致FDC的重要原因。 n常见EDMD、LGMD、DCM， 其中EDMD或LGMD类 型可合并出现心脏损害 心脏损害主要表现有 n心律失常 一个meta分析中显示，299个明确LMNA基因突变的 患者，其中190个为EDMD或LGMD，109个为DCM 患者。30岁以上的患者中92有心律失常，死亡的患 者中46死于猝死。 n心脏扩大，心力衰竭 n限制型心肌病、右室扩大等 van Berlo JH, de Voogt WG, van der Kooi AJ et al. Metaanalysis of clinical characteristics of 299 carriers of LMNA gene mutations: do lamin A/C mutations portend a high risk of sudden death? J Mol Med 2005; 83 (1): 7983 讨论 该突变与基因、蛋白的结构和功能关系 n发生突变的部位位于第一外显子，在其头部球状功能 区。 n发生突变后，该