中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究

文献翻译,妍妍,中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究,摘要：草药膜荚黄芪根部的免疫增强作用与它的多糖部分，即黄芪多糖（APS）密切相关,我们再此通过检测细胞增殖和细胞因子产量证明APS能激活鼠的B细胞和巨噬细胞，而不能激活T细胞。通过流式细胞检测分析及共聚焦激光扫描显微镜检测发现，荧光标记的APS（FL-APS）能够选择性侵染鼠的B细胞、巨噬细胞及人的肿瘤细胞系THP-1(单核白血病细胞)。这种与B细胞、巨噬细胞特异性的结合可被细菌脂多糖（LPS）竞争性地抑制。兔抗鼠免疫球蛋白抗体（Ig）能够抑制APS诱导的B细胞增殖和APS与B细胞结合。此外， APS能够有效刺激C3H/HeJ小鼠（其TLR4分子突变而无信号传导能力）脾脏B细胞增殖 ，上述结果表明，APS通过细胞表面不依赖TLR4而是通过免疫球蛋白来激活B细胞。有趣的是，APS对 C3H/HeJ小鼠巨噬细胞的刺激无反应，说明APS介导的激活巨噬细胞作用与TLR4密切相关。抗鼠TLR4单克隆抗体能够部分抑制APS与巨噬细胞的结合，提示APS与细胞表面的TLR4具有直接的相互作用。这些结果从分子水平揭示APS免疫作用机理。,材料和方法,动物和抗体 1、动物和抗体 试验动物：雌性BALB / c小鼠，购自北京大学健康科学实验动物中心；雌性C3H/HeJ小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。所有的动物均饲养于免疫教研室。 抗体：抗鼠TLR4或RP105单克隆抗体，购自Invivogen公司；鼠抗人CD14单克隆抗体购自RD公司；兔抗鼠多抗和未免疫的兔或鼠IgG由本实验室制备。 2、黄芪多糖的制备 黄芪根切片，用沸水萃取三次。上清液加到用0-2 mol / L氯化钠线性梯度洗脱的DEAE-Sephacel中。碳水化合物组分浓度的测定采用苯酚 - 硫酸法。碳水化合物各组分混合，并且沉淀用酒精洗三次。产生的多糖提取物是针对水的几个变化透析的，然后冷冻干燥。最终产品的碳水化合物的含量为97，提取的蛋白质和核酸污染可以忽略不计（在280和260nm处的吸光度值接近于零）。用凝胶过滤法测定提取物的分子量大约35001.58*106 。应用薄层色谱法和气相色谱分析糖成分表明，鼠李糖，木糖，葡萄糖，半乳糖，人，和FRU与鼠李糖：木糖：葡萄糖：半乳糖：人的摩尔比为：FRU4.9:4.7:8.3:122.2:2.2:3.1。,3、细胞培养液 所有的细胞在R10的RPMI-1640培养液中培养（Hyclone公司），并添加10（V / V）FCS（Hyclone公司）、青霉素/链霉素（100 U / ml）、L-谷氨酰胺（2mM）、和2-ME(5*105 M)。肿瘤细胞系的Raji细胞，THP-1，CCRF-CEM，来自于美国的ATCC，并在其实验室保存。 4、荧光标记的APS和葡聚糖的制备 基本上与Glabe 所描述的情况一致。简言之，APS或葡聚糖（分子量70,000，Sigma公司）的溶液（20mg/ml）与0.2毫克溴化氢（50mg/ml）和0.2M氢氧化钠混合，在PH11时磁力搅拌15分钟。在pH8.0时对钠硼酸盐缓冲液透析后20小时，经溴化氰活化的APS或葡聚糖与2mg荧光素胺（Sigma公司）体积小于4毫升混合10小时。合成的荧光标记的多糖经葡聚糖凝胶G-50（Pharmacia公司）的凝胶过滤柱（2*40厘米）与无荧光素胺分离。收集洗脱组分（3毫升/管）并且在440nm处波长处测荧光素胺的浓度。用含荧光素胺的梯度稀释液(从 2 到 200M)制备标准曲线。用稀释后的葡聚糖构建标准曲线。 5、小鼠脾脏T细胞，B细胞，贴壁细胞和腹膜巨噬细胞的准备 BALB / c或C3H/HeJ小鼠的脾脏，轻轻按在不锈钢筛（200目）上用注射器柱塞捣碎。红细胞用蒸馏水短时间处理裂解，脾细胞洗涤两次，使之在完全R10中悬浮。,染色后的THP-1细胞散布在载玻片上，固定后使用Leica TCS SP2的共聚焦激光扫描显微镜观察。 在一些实验中，小鼠的贴壁脾细胞，纯化的B淋巴细胞，THP-1细胞，巨噬细胞在染色前使用5g/ml的胰蛋白酶在37处理20分钟。 昆布多糖，一个低分子量中性-葡聚糖的聚合物，购自Sigma公司。低聚甘露糖由付博士（中国科学院信息工程研究所）提供。抑制实验，细胞（1*106/管）分别用1 mg/ml葡聚糖、昆布多糖、低聚甘露糖、LPS（Sigma,）或400 lg/ml Abs处理1小时，洗后用FL-APS（0.3mg/ml）在4处理1小时，细胞悬浮于1ml PBS中用流式细胞仪分析。 10、内毒素污染的测定 APS和LPS样品（30g / ml的APS和0.01g/ml脂多糖）中的内毒素浓度测量用LAL显色试剂盒（益华生物）。 11、统计学分析 每个实验至少重复三次。结果是以平均值标准误来表示。数据用t检验进行比较。P值0.05为差异显著。,结果,1、APS和葡聚糖的荧光标记（图1）,溴化氰活化的APS（A）和葡聚糖(B)与荧光素胺在室温下反应10小时。 混合物经Sephadex-G50柱分级分离，荧光素胺与多糖的结合物与未结合的荧光素胺分离开，对各组分荧光素胺（）和糖类（）的浓度（g/ml）进行了测定。结合物数量很少，且较未结合的荧光素胺洗脱的快。,2、在体外用APS激活B淋巴细胞和巨噬细胞,图（2A），用APS 、FL-APS或葡聚糖在指定浓度下刺激BALB/ C小鼠脾细胞。APS 、FL-APS同样有效并且脾细胞在体外增殖显著。表明APS与荧光素胺的结合对其免疫生物学活性没有明显改变。 图（2B和2C）， APS在体外主要刺激B细胞不能直接激活T细胞 。 图（2D），APS ，葡聚糖，ConA或单独培养基（MED）刺激后，脾细胞中IL-2和action mRNA的表达通过RT-PCR来检测。 APS不能诱导脾细胞中IL-2 mRNA的表达 。,3H 胸腺嘧啶掺入法（CPM）,当用APS或葡聚糖刺激BALB / c小鼠的巨噬细胞40小时，发现APS组培养上清中IL-1和TNF-显著增多，这表明APS也能激活巨噬细胞。,表1 APS刺激腹腔巨噬细胞细胞因子产生（IL-1和TNF-浓度采用ELISA法测定）,3、小鼠巨噬细胞、B细胞和人类THP-1细胞株选择性结合APS,（流式细胞仪分析）,图（3A - E）用Fl-APS或fl-dextran染色新鲜BALB / c小鼠巨噬细胞、T细胞和B细胞通过Fl-APS染色与其功能研究结果相一致的是小鼠的脾细胞、腹腔巨噬细胞、脾贴壁细胞（主要是巨噬细胞）和B细胞，而不是T细胞 。 图（3F - H）经胰蛋白酶预处理后，APS与B细胞和巨噬细胞的结合显著下降,BALB/ C小鼠的脾细胞（A），脾贴壁细胞（B），巨噬细胞（C），B细胞（D）和T细胞（E）用FL-葡聚糖（无阴影直方图）或FL-APS（暗直方图）胰蛋白酶预处理脾贴壁细胞（F）巨噬细胞（G），B细胞（H）（灰度直方图）,小鼠巨噬细胞与APS的稳定结合（图4）,当FL-APS染色的巨噬细胞在4或37孵育6小时后，其荧光强度几乎保持不变，这表明APS和细胞表面受体之间的结合是相当稳定的。,人类肿瘤细胞株的T，B细胞和单核细胞与FL-APS的结合能力（图5）,图（5A，B和D）经FL-APS染色后呈正相关。 图（5C） THP-1细胞经胰蛋白酶预处理后失去了与FL-APS结合的能力 。 图（5E）共聚焦激光扫描显微镜可以观察到FL-APS与 THP-1细胞特异性结合 （E中的显微照片表示通过光线和绿色荧光渠道合并后的图像)。a:THP-1细胞用FL-APS染色 b: THP-1细胞用FL-dextran染色,THP-1（A）Raji细胞（B细胞淋巴瘤） （B）和CCRF-CEM（T淋巴细胞白血病） （D）细胞用FL-葡聚糖（无阴影直方图）或FL-APS（黑直方图） THP-1细胞用胰蛋白酶预处理（灰度直方图）,（流式细胞仪分析共聚焦激光扫描显微镜观察 ）,4、LPS竞争性抑制FL-APS与细胞结合（表2）,在APS中LPS内毒素活性约为0.15，表明如果APS中有内毒素污染的话，是可以忽略不计的。,（*LAL显色试验） 鲎试验偶氮基质显色法,为了解决APS和LPS是否有共同的细胞受体，通过流式细胞仪分析脂多糖被用来抑制FL-APS与靶细胞的结合。（图6）,脂多糖虽然不能完全抑制但能有效的抑制 APS与靶细胞结合。,BALB / c小鼠B细胞（A）和THP-1细胞（B）（灰度直方图）,5、B淋巴细胞膜免疫球蛋白作为APS功能受体,兔抗鼠抗体显著抑制APS诱导BALB / c小鼠脾细胞的增殖，而Abs并没有影响ConA诱导T细胞增殖。,图7. 3H胸腺嘧啶掺入法（CPM）,图8. BALB / c小鼠脾细胞（A）和腹腔巨噬细胞（B）用FL-葡聚糖（阴影直方图）或FL-APS处理或不处理的兔抗鼠抗体（ mIg）或对照兔IgG（RIG）。,兔抗鼠抗体部分阻断APS与B细胞结合，而不是巨噬细胞,6、TLR4不参与APS诱导B细胞的活化 3H胸腺嘧啶掺入法（CPM） 图9,LPS诱导BALB / c小鼠脾细胞（B细胞）的增殖，而不是C3H/HeJ小鼠。相比之下，C3H/HeJ和BALB / c小鼠的脾细胞对APS的刺激反应是一致的，表明APS激活小鼠B细胞上TLR4介导的信号转导通路没有参与（或者至少不是必须的）。,7、TLR4在APS-介导的巨噬细胞活化中的作用（图10、11）,APS、-干扰素、葡聚糖、LPS、刺激C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞检测培养上清中TNF-的浓度 发现APS刺激C3H/HeJ小鼠巨噬细胞（表达突变的TLR4）没有产生TNF- ，鉴于黄芪多糖能激活BALB / c小鼠的巨噬细胞（表1），说明TLR4在APS介导的巨噬细胞活化中起重要的作用。,培养上清中TNF-浓度采用ELISA试剂盒测定结果用肿瘤坏死因子-的浓度（pg/ml）来表示 （图10）,抗TLR4单克隆抗体显著抑制FL-APS与BALB / c小鼠的腹腔巨噬细胞的结合，表明细胞表面上的TLR4与APS有直接的相互作用。,图11,APS在巨噬细胞的可能受体 （表3）,讨论,APS与外周血B细胞表面的膜免疫球蛋白具有很高的亲和力。 FL-APS结合的B细胞荧光强度分布广泛， FL-APS无法染色Raji细胞（B细胞淋巴瘤） ，是由于Raji细胞是单克隆的，它们的膜免疫球蛋白对APS亲和力低。研究结果表明，APS能够与膜免疫球蛋白结合，并诱导细胞增殖和产生小鼠B细胞抗体（数据未显示）。由于APS能够在TLR4信号缺乏的情况下激活B细胞，它一定是与B细胞表面的膜免疫球蛋白结合而激活B细胞。用APS刺激BALB / c小鼠巨噬细胞，产生的IL-1和TNF-的量增加，而在体外，对于APS的刺激，C3H/HeJ小鼠的巨噬细胞没有反应，表明TLR4（或TLR4受体复合物）可能作为APS受体候选之一。抗TLR4的单克隆抗体能够抑制FL-APS与巨噬细胞结合也支持这一观点。在巨噬细胞表面上存在与TLR4无关的APS识别受体（ABR-X,表3）是可能的，因为抗TLR4的单抗仅表现为部分抑制FL-APS结合。 LPS依赖于mIg和TLR4活化B细胞，并通过激活协同的信号转导通路而产生更有效的反应。并且它能够抑制B细胞和APS结合的能力，这表明LPS与APS有共同的抗原表位。现已证明，脂多糖的类脂A是TLR4的高亲和配体。还有证据表明，多糖部分在LPS通过TLR4诱导细胞的活化中有着不可或缺的作用。多糖可以作为CD14分子，RP105，MD1或MD2的一个桥梁，间接与TLR4作用。,无论是在基础研究和治疗应用方面