[工程科技]第二章 菌种与种子扩大培养.ppt

第二章：菌种的来源及扩大培养,第一节 发酵工业常用微生物菌种及要求 第二节 工业微生物菌种选育 第三节 生产菌种的改良 第四节 种子的扩大培养,第一节 发酵工业常用微生物菌种及要求,一、发酵常用的工业微生物菌种 细 菌 放 线 菌 霉 菌 酵 母 菌 担 子 菌 藻 类,从自然界分离的菌种,1.细菌（bacteria),2.放线菌(actinomyces),3.霉菌(mould),4.酵母(yeast),球拟酵母属产生甘油、甘露醇、烃类等。 红酵母属具有产脂肪的能力,酵母,由于酵母细胞内含有丰富的蛋白质、维生素和各种酸，所以，酵母细胞本身又是医药、化工和食品工业的重要原料。 如单细胞蛋白(一种饲料蛋白)、酵母片、核糖核酸、核苷酸、辅酶A及酶制剂等。,微生物资源,目前已确定的微生物种数在十万种左右,但仍正以每年发现几百至上千个新种的趋势。 (05年发现494种，韩国68种，日本为59种，美国44种，中国42种，德国41种） 已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%。 微生物的代谢产物据统计已超过1300多种，而大规模生产的不超过100多种； 微生物酶有近千种，而工业利用的不超过四五十种。可见潜力很大。,二、工业化菌种的要求,原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。,易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期短。,抗杂菌和噬菌体的能力强。,菌种遗传性能稳定，不易变异和退化。,产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,第二节 工业微生物菌种选育,一、自然选育根据菌种的自发突变而进行菌种筛选过程。 突变频率低。 二、诱变选育通过诱变剂处理，突变频率提高，随机性大，如果 筛选方法得当，也有可能定向地获得好的变异株。 目的： 提高产量 提高质量 增加品种 改善工艺条件 例：青霉素 色素 土霉素 泡沫 红霉素 噬菌体,如：第一株青霉素生产菌是从美国伊利诺斯州 长霉的葡萄柚中分离出来的； 第一株头孢霉素生产菌则来自于意大利撒 丁岛的污水中。（黄青霉支顶孢菌生产头孢菌 素C 顶头孢霉菌 ） 目前工业上应用的优良菌种，几乎都是经过诱变处理后获得的突变株。 在40年内青霉素生产菌通过诱变育种使青霉素产量增加了近万倍,达到10万u/ml 左右。 谷氨酸产生菌经紫外诱变处理,产酸率提高了 31%;,一、自然选育 自然选育的一般过程,1.制定方案,首先查阅资料，了解所需菌种的生长和培养特性，制定方案，才能有针对性地采集样品和分离菌种。 例如 与水、空气相比，土壤具备了微生物所需的养分，是微生物最集中的地方。但不同的微生物由于生理特性不同，采集的场所有所选择。 采样地点要根据筛选目的、微生物的分布及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析。如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。,2.标本采集,取离地面515cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等 如：森林土有相当多的枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶生产菌的生长。 又如：在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的生产菌。,收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接进行分离。 如果样品含所需菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖(富集)培养。 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。,3.增殖培养,例如：筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长。 筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一碳源进行增殖培养，能更快更准确地将脂肪酶产生菌分离出来。 在分离放线菌时，可现在土壤样品悬液中滴加10%酚数滴，以抑制霉菌和细菌的生长。 适当控制培养基的温度、pH值,增殖培养（培养基）,4.纯种分离,富集培养后，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但仍有多种微生物混杂。 所以有必要进行分离纯化，才能获得单菌落。方法: 稀释涂布法 划线分离法 利用平皿的生化反应进行分离,利用平皿的生化反应进行分离,透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑菌圈法,透明圈法,在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物会在菌落周围产生透明圈。 该法在分离水解酶产生菌时采用较多，产有机酸菌也可用。 如：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成透明圈。 圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。,筛选半纤维素酶 划线产透明圈的细菌 点种细菌双层水解圈,变色圈法,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。 如：筛选果胶酶生产菌时，用含有0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，待菌落长成后，加入0.2%刚果红染色液4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。 刚果红的变色范围为pH35。 在pH5时，它以磺酸钠形式存在，显红色； 在pH3时，它以邻醌式内盐的结构存在，显蓝色。 果胶酶水解果胶形成游离的半乳糖醛酸,变色圈法,又如：在分离谷氨酸产生菌时，在培养基中加入溴百里酚蓝指示剂若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色。 pH6.2以下为黄色， pH6.2以上为蓝色.,生长圈法,通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌.工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。 将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。 如：嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落为嘌呤产生菌。 同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌，都可采用营养缺陷型作为工具菌通过生长圈法筛选。,抑菌圈法,常用于抗生素产生菌的分离筛选。 工具菌采用抗生素敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。如青霉素产生菌的筛选。,5.筛选初筛和复筛,由于纯种分离后得到的菌株数量很大，如果对每一株都作全面或精确的性能测定，工作量大且不必要。一般采用两步法，即初筛和复筛。经过多次重复筛选，直到获得1-3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产实验。 （1）初筛 A 平板筛选 B 摇瓶发酵筛选（电泳、纸层析）,A 平板筛选显色或生化反应,纯化分离阶段本身就是筛选过程。对于那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选出来的菌落，即随机挑选的菌落，需经过平板筛选。 平皿快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平皿上肉眼可见的显色或生化反应（进而电泳、层析）。 如：筛选产生碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌时，可将分离得到的菌株，点种在含有0.30.4%酪蛋白的琼脂平板上，适温培养后，测量形成的水解圈直径和菌落直径的比值来表示酶活力的强弱。挑选酶活力强的菌株进一步用摇瓶培养筛选。,A 平板筛选琼脂打孔,又如在筛选谷氨酸菌种时，用不含有机氮（如蛋白胨）的培养基，使分离得到的菌株在这种培养基上形成单菌落，用68mm的打孔器打孔，取出放在滤纸上，喷上茚三酮，出现呈色圈（蓝色、偏紫色）。取色深的。 进一步摇瓶进行电泳或纸层析鉴别。,原理：茚三酮能使氨基酸氧化脱羧又脱 氨，反应结果产生还原的茚三酮和 氨，这二种产物又互相作用产生蓝 色或偏紫色产物，产物的多少与颜 色深浅成正比，可以作为氨基酸的 定量分析。,B 摇瓶发酵筛选,平皿法为固体培养基，与液体培养条件差距较大，因此经过平皿法后与摇瓶法作对比试验。 一般一株接一个瓶，得到的发酵液加入琼脂培养基孔中，培养基中加入鉴定菌（测定抗生素产生菌）或底物（测定酶制剂产生菌 ）， 用对应的溶菌圈或水解圈等鉴别。,（2）复筛,经初筛后可简便快速淘汰8590%不符合要求的微生物，剩下较好菌株进行摇瓶复筛。 通常一株要重复35个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定： 蛋白酶用分光光度计； 脂肪酶用NaOH滴定等。 最后选出23株。,6.生产性能的测定,进行生产性能测定，确定是否适合生产要求，是否可用于生产。 这些特征包括： 形态、 培养特征、 营养要求、 生理生化特征、 发酵周期、 产品品种和产量、 耐受最高温度、 生长和发酵最适温度、 最适pH值、 提取工艺等。,二、常规诱变育种,(一)诱变前的处理,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定 同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 计形态变异的菌落数， 计算突变率 平板分离 挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法 重复筛选 摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,1、出发菌株的选择,用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。 出发菌株会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解。 挑选出 变异幅度广 产量高的出发菌株 对诱变剂敏感性大,（1）自然界直接分离到的野生型菌株 （2）经历过生产条件考验的菌株 （3）已经历多次育种处理的菌株,2、菌种的纯化选优,微生物容易发生变异和染菌。 一般丝状菌的野生菌株多数为异核体。 生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然产生突变株等。 以上会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。 如果一个菌种遗传背景复杂，既不稳定，用诱变剂处理后的变株中，负变率将增加。 特别对诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，效果很差，发酵单位反而变得更低。,3.同步培养,(1)温度 最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。,3.同步培养,(2)培养基成分控制 培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓慢生长直至生长停止。 因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。 另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的，能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。,3.同步培养,(3)其他 对于光合细菌可以将不同步的细菌经光照培养后再转到黑暗中培养，这样通过光照和黑暗交替培养的方式可获得同步细胞；对于不同步的芽孢杆菌培养至绝大部分芽孢形成，然后经加热处理，杀死营养细胞，最后转接到新的培养基里，经培养可获得同步细胞。 环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致胞内某些物质合成，它合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。,4. 制备单孢子或单细胞悬液,斜面或预培养的质量对诱变有较大的影响 要求单孢子或单细胞悬液。因为分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。 在制取孢子悬液时，务必除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的，多核细胞经诱变剂处理后，某个核发生有益的突变极易被其他尚未突变的核竞争性地抑制，多核菌体会降低单位存活菌的突变率。,4. 制备单孢子或单细胞悬液,菌悬液：采用生理状态一致生长旺盛对数期的单细胞，或采用成熟而新鲜的孢子。 由此细胞对诱变剂的敏感性和DNA的复制有利，易于造成复制错误而增加变异率。 预培养：可以补给嘌呤、嘧啶或酵母膏等丰富的碱基物质，加速DNA复制提供营养而增加变异率。 通常将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养2060 min，再进行诱变处理， 霉菌孢子浓度为： 10 8 个/ml。放线菌孢子浓度为：10 6 107个/ml。,（二）诱变育种方案设计,诱发突变有可能出现多种多样变异性突变株。除了高产性状外，还要考虑其他有利性状。 例如： 生长速度快、产孢子多； 消除某些色素或无益组分； 能有效利用廉价发酵原材料； 改善发酵工艺中某些缺陷(如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝量太多、自溶早、过滤困难等)。 但是所定的筛选目标不可太多，要充分估计人力、物力和测试能力等，要考虑实现这些目标的可能性。要选出一个达到一定产量的高产菌株，往往要筛选数千个左右的突变株，经历多次诱变和筛选，才能达到目的。,（二）诱变育种方案设计,1.突变的诱发 A.诱变剂接触DNA分子 B. DNA损伤的修复 C.从前突变到突变 D.从突变到突变型,A.诱变剂接触DNA分子,诱变剂接触DNA分子，造成DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。 例如：紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体是一种前突变。 突变的诱发还和基因所处的状态有关，在培养基中加入诱导剂使基因处于转录状态，可能有利于诱变剂的作用。,B. DNA损伤的修复,五种修复方式： （1）光复活作用 （2）切补修复 （3）重组修复 （4）SOS修复系统 （5）DNA多聚酶的校正作用,（1）光复活作用,人们发现某些经紫外线照射过的放线菌孢子，如果在可见光下培养时，存活数明显大于在黑暗中培养的同一样品。 经研究证明这是由一种为可见光所激活的酶在起作用。,（2）切补修复,是在四种酶作用下（无需光），促进DNA损伤修补。主要包括： 核酸内切酶识别DNA损伤部位，并在5端作一个切口， 再在外切酶的作用下从5端到3方向切除损伤部位， 此后在DNA聚合酶的作用下以损伤处相对应的互补链为模板合成新的DNA单链片段，填补切除后空下的空隙； 最后在连接酶的作用下将新合成的单链片段与原有的单链以3,5磷酸二脂键相连接完成修复过程。 切除修复功能广泛存在于原核生物和真核生物中，也是人类细胞中DNA损伤切除修复的主要方式之一。 咖啡碱能抑制切补修复系统，因而增强诱变作用。,（3）重组修复,必须在DNA进行复制的情况下进行，又称复制后修复。 是在不切除胸腺嘧啶二聚体。 以带有二聚体的单链为模板合成互补单链，可是在每一个二聚体对面留下一个空隙。 一般认为 通过染色体交换，空隙部位就不再面对着二聚体，而是面对着正常的单链，在这种情况下，DNA多聚酶和连接酶就能把空隙部位修复好。,（4）SOS修复系统,这是一种能够造成误差修复的“呼救型号”修复系统。 当DNA受到诱变剂损伤而阻断复制过程时，损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻碍，而进行DNA的修复。在修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行 DNA的修复合成，并将合成 的DNA片断插入受损 DNA的空隙处。 SOS修复系统的修复作用容易导致基因突变，大多数经诱变所获得的突变来源于此修复系统的作用。 SOS修复故名思意是一种急救性的修复，忙中就难免有错，故也叫差错倾向修复（Error prone repair）这种修复是为了保命也就管不了修补的片段是否正确。,（5）DNA多聚酶的校正作用,细胞还具有对出现差错加以校正的功能。 大肠杆菌中DNA的复制依赖于三种 DNA多聚酶（多聚酶、 ）的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用外，还具有3到5核苷酸外切酶的作用。 如果 DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么，它切除不正常核苷酸的能力减弱 ，菌体的突变率相应地提高，成为赠变突变型。 多聚酶为 DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。,C.从前突变到突变,前突变形成后，修复系统可以分为校正差错和引起差错两类。 不利于 突变的修复： 光复活作用 切补修复 DNA多聚酶修复 利于突变的修复： 重组修复 SOS修复系统修复 这两种修复作用有引起差错的性质。,D.从突变到突变型,突变基因的出现并不等于突变型的出现，表型的改变落后于基因型的改变的现象称为表型迟延。 表型迟延的原因： （1）分离性迟延 由于对数生长期细胞含有几个核质体，当其中一个发生突变时，这个细胞变成异核体。突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达 ，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的突变型基因，其性状才得以表达。 （2）生理性迟延 突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，必须等到原有基因的产物稀释到没有程度后才能表现出来。即经过分裂多次，好几个世代之后。,诱变剂,物理诱变剂,化学诱变剂,烷化剂 碱基类似物 吖啶化合物,紫外线 X射线 射线 快中子 激光 射线,2、诱变剂的种类及选择,诱变剂处理方式可分为:单因子处理和复因子处理，复因子处理一般先用弱诱变因子，后用强诱变因子,物理诱变剂中紫外线应用最广,紫外线作用光谱正好与细胞内的核酸的吸收光谱相一致，因此在紫外光的作用下能使DNA链断裂、 DNA分子内和分子间发生交联形成嘧啶二聚体 。 操作： 一般用15W的UV灯，照射距离为30cm，在无可见光（只有红光）的接种室或箱体内进行。由于UV的绝对物理剂量很难测定，故通常选用杀菌率或照射时间作为相对剂量。 照射时间：不短于1020s，不长于1020min. 单细胞悬液放置在直径为6cm的小培养皿中，无盖照射。 杀菌率：9099%，现降低70%80%。,各种化学诱变剂常用的浓度 处理时间,诱变育种的基本环节 以产量突变株为例：,出发菌株,绝大多数个体死亡,少数存活,多数未变 少数突变,多数负变 少数正变,多数变幅小 少数变幅大,多数不宜投产 少数宜投产,存活率 突变率 正变率 高产率 投产率,诱变,平板分离,纯培养,初筛,重筛,3.筛选的方法,（1）制定筛选方案 （2）营养缺陷型的筛选方法 （3）突变株的筛选 随机筛选（摇瓶、琼脂快） 理性化筛选（代谢控制）,（2） 营养缺陷型的筛选方法,营养缺陷型菌株的应用 a.营养因子产生菌的筛选、 b.代谢控制育种 c.杂交、重组育种遗传标记,(2)营养缺陷型的筛选方法,诱变 中间培养 淘汰野生型 检出营养缺陷型 确定生长谱。 中间培养的目的是减少以后筛选中再产生分离子，其培养基是完全培养基（CM）或补充培养基（SM），并且培养过夜。,淘汰野生型菌株,目的：富集营养缺陷型菌株 方法：1 ）抗生素法 2 ）菌丝过滤法 3 ）差别杀菌法（芽孢菌） 4 ）饥饿法 1）抗生素法 细菌青霉素法(细胞壁为肽聚糖类，正常细菌敏感，营养缺陷型处于休止状态不能生长而被保留）。 丝状真菌、酵母菌制霉菌素法（作用细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤）。,缺陷型的浓缩：,抗生素法 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。 方法：将菌培养在含抗生素的MM基中,2）菌丝过滤法,真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。 把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。 继续培养，每隔34h过滤一次，重复34次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo（缺陷型）孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,3）差别杀菌法（芽孢菌）,利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。 此时将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。,营养缺陷型菌株检出,检出方法： 逐个测定法（点植对照法）、 夹层平板法（延迟补给法）、 限量营养法、 影印接种法等 。,逐个检出法：将诱变后的孢子或菌体经富集培养涂布到完全培养基上,缺陷型的检出：,夹层培养法,先底下倒三层，首先出现的为野生型，在背面作标记，再倒入完全培养基，后生长的为营养缺陷型。,影印法,（3） 突变株的筛选,育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。 1）随机筛选 摇瓶筛选法 琼脂块筛选法 2）理性化筛选 初级代谢产物高产菌株的筛选 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选,1）随机筛选 摇瓶筛选法,摇瓶中培养，然后测定其发酵生产能力。 工作量大、时间长、操作复杂。,（3） 突变株的筛选 1）随机筛选 摇瓶筛选,第一代：出发菌 分离到平皿上 挑选菌落 50株 35株,初筛 复筛,结合指示剂 呈色剂或底物,提供第二代出发菌,诱变,第二代：出发菌 分离到平皿,40株 40株 40株 40株 40株,诱变 挑菌落,初筛 复筛,50株,35株,提供第三代出发菌,结合指示剂 呈色剂或底物,200个,一瓶一株,一瓶一株,1）随机筛选 琼脂块筛选法,春雷霉素生产菌的筛选,2）理性化筛选 初级代谢产物高产菌株的筛选 降低终产物浓度,根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制，这对于生产菌本身是有意义的，避免合成过多的代谢物而造成能量的浪费。,协同反馈抑制，当其中一产物单独过量时则无抑制作用。,缺少,2）理性化筛选 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选,(a) 利用营养缺陷型筛选,氯霉素,灰黄霉素 四环素 制霉菌素,(d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株,“葡萄糖效应” 能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶(包括许多抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素。 抗生素生产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制抗生素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。,筛选去碳源分解代谢调节突变株,因此，可以利用这些被阻遏或抑制的碳源或氮源作为惟一可供菌利用的碳(或氮)源，进行抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。 例如，将菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和组氨酸为惟一氮源的培养基中连续传代后，可选出去葡萄糖分解代谢调节突变株。正常的组氨酸分解酶类是被葡萄糖分解代谢物阻遏的，如果突变株能在这种培养基中生长，说明它具有能分解组氨酸而获得氮源的酶。,利用葡萄糖的（毒性）结构类似物筛选去碳源分解代谢调节突变株,例如，以半乳糖作为可供菌生长利用的惟一碳源，再于培养基中添加葡萄糖的结构类似物，该结构类似物不能为菌所利用，但可抑制菌利用半乳糖。所以，在这种培养条件下，只有去葡萄糖分解代谢调节突变株能够利用半乳糖进行生长，原始菌株由于不能利用半乳糖而不能生长。因而可选出去碳源分解代谢调节突变株。,(e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。,许多抗生素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。 因此，氨基酸的代谢和抗生素合成有着密切的联系，打破菌的氨基酸代谢的调节，可能导致抗生素高产。,4.突变基因的表现,菌种的发酵产量决定于 菌种的遗传特性 菌种的培养条件 突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件， 例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变株，在原培养基上与出发菌株相比较，发酵单位的提高并不明显，但是在原培养基配方中增加碳、氮浓度，调整磷的浓度，该菌株就表现出代谢速度快、发酵产量高的特性。并采用通氨补料的工艺，使产量有了新的突破。,第三节 生产菌种的改良,诱变育种可以获得高产菌株。但不能达到定向育种的目的。 菌种的改良的方法： 一、常规的杂交育种 二、原生质体融合 三、DNA重组,一、常规的杂交育种,杂交育种：是一种选用两个已知性状的供体菌和受体菌作为出发菌株，定向地改变微生物的遗传性，从而获得新菌种的现代育种技术。 该法克服了诱变育种定向性差的缺点。,常规的杂交育种不需用脱壁酶处理，就能使细胞接合而发生遗传物质重新组合 。 例如：青霉菌的杂交过程,杂交育种的遗传标记 营养缺陷型 常用 抗性标记,二、原生质体融合育种,用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，从而获得异核体及重组子，这一技术叫原生质体融合。,1.原生质体的制备,各种微生物的原生质体制备过程所用来破壁的酶也不同： 细菌主要用溶菌酶。 酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶或纤维素酶。 为了防止原生质体破裂，要把原生质体释放到高渗缓冲液或高渗培养基中。,2.原生质体的融合,制备好的二亲本原生质体可通过化学因子诱导或电场诱导进行融合。 化学因子诱导：PEG（聚乙二醇）作为融合剂。 PEG具有促进原生质体融合的作用。再加入Ca2+和Mg2+等阳离子，PH9，可得到高融合频度。 电融合技术：原生质体在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，然后加直流脉冲后，原生质体膜被击穿，导致融合的发生。可在显微镜下进行，并可在镜下挑出融合的原生质体。该法为一个空间、时间同步的可控过程，对细胞无毒害作用。,3.原生质体再生,原生质体已经失去细胞壁，仅有一层厚约10nm的细胞膜。它具有生物活性，但不是正常的细胞，在普通培养基上不能生长。两个原生质体融合后必须涂布于再生培养基上，使其再生。 再生率常为百分之零点几至百分之几十。 再生培养基以高渗培养基为主，增加高渗培养基的渗透压或添加高于0.3mol/L蔗糖溶液均可增加再生率。,4.融合子选择,主要依靠在选择培养基上的遗传标记。两个遗传标记互补就可确定为融合子。 营养缺陷型标记选择：为常规而准确的选择手段。但往往会造成一些优良性状的丢失和所代谢物产量下降。 灭活原生质体融合法：在融合中灭活1个亲株的原生质体与另一亲株的原生质体融合，被灭活的亲株可不加任何遗传标记，只需对活菌株进行标记，大大减少融合前亲株进行遗传标记的工作量。（热、紫外线、电离辐射、生化试剂、抗生素等） 荧光染色法：在酶解制备原生质体时向酶液中加入荧光色素，使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素，带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具再生能力。 在各菌落中选择融合子是很繁琐的。,酿酒酵母不能直接利用淀粉，糖化酵母虽能利用淀粉，但发酵能力很弱，这两个不同属的菌株融合后，有可能筛选到能利用淀粉直接发酵生产酒精的融合子。,灭活原生质体融合技术 单一亲株灭活（灭活原养型再筛选原养型） 双亲株灭活 例如将链霉素产生菌灰色链霉菌的 高产菌株 81- 36、 84-102 野生型菌株 4.181、 4.139 四个亲株的原生质体等量混合后，均等分成两份，分别用热和紫外线灭活，然后进行融合，获得的融合子中有一株兼有生产菌株的效价高和野生型菌株的生长快的双重优点。（由于致死损伤不一致可通过融合互补产生活的重组体） 该方法由于可以不用遗传标记等优点，在育种工作中已初见成效。,原生质体融合(protoplast fusion),三、DNA重组技术（分子育种）,利用基因工程能够使跨种生物的DNA插入到某一细胞质复制因子中，进而引入寄主细胞进行成功表达。 （一）DNA重组过程,获得目的基因 选择基因载体 体外重组 外源基因导入受体细胞（细菌、植物、动物） 筛选和鉴定 应用,常用载体,原核受体细胞： 质粒、噬菌体 真核细胞受体： SV40病毒（动物）、Ti质粒（植物）,限制性内切核酸酶,重组DNA技术一般包括步骤 （1）制备供体DNA （2）制备载体DNA （3）连接载体和供体DNA片断 （4）将受体菌制成原生质体 （5）转化作用 （6）再生和选择,第四节 菌种的扩大培养,一、种子扩大培养的任务 二、种子制备的过程 三、种子质量控制,一、 种子扩大培养的任务,将保存在砂土管或冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，从而获得一定数量和质量的纯种。,二、种子制备的过程,菌种的扩大培养一般包括： 斜面菌种的培养 摇瓶或茄子瓶培养 实验室种子制备阶段 一级种子的培养 二级种子的培养 生产车间种子制备阶段 发酵罐培养,(1)放线菌孢子制备: 采用斜面，培养基中含有一些适合产孢子的成分， 如：麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1%，氮源不超过0.5%)。 碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子的形成； 氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。,1.孢子制备,放线菌孢子制备,一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。 培养温度一般为28C，少数为37C 。 培养时间为514天。 放线菌种子扩大培养的过程 菌种 母斜面（孢子） 子斜面（孢子） 摇瓶种子（菌丝） 种子罐 发酵罐,（2）霉菌孢子的制备,一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。其营养成分适合霉菌孢子的繁殖。 培养温度一般为2528 培养一般为414天。,（3）细菌培养物的制备,斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用做有机氮源。培养温度一般为：37， 培养时间一般为12天， 产芽孢的细菌则需培养515天。,2.种子制备,（1）摇瓶种子制备 （2）种子罐种子制备 3.种子培养 两步法： 微生物生长与产酶条件相差很大。 菌体先在营养丰富的培养基上大量繁殖，收集菌体浓 缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基。,三、种子质量的控制,1.影响孢子质量因素,a.孢子培养温度 例：龟裂链霉菌斜面最适温度为36.537 ，如果高于37 ，则孢子成熟早，易老化，接入发酵罐后，就会出现菌丝对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升提前，发酵产量降低等现象。培养温度控制低一些，则有利于孢子的形成。龟裂链霉菌斜面先放在36.5 培养3天，再放在28.5 培养1天，所得的孢子数量比在36.5 培养4天所得的孢子数量增加37倍。,b. 孢子培养时间,如：土霉素菌种斜面培养4.5天，孢子尚未完全成熟，冷藏78天菌丝即开始自溶。而培养时间延长半天(即培养5天)，孢子完全成熟，可冷藏20天也不自溶。 过于衰老的孢子会导致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。,c. 孢子的冷藏时间,斜面孢子的冷藏时间，对孢子质量也有影响，其影响随菌种不同而异，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。 有报道: 在链霉素生产中，斜面孢子在6 冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月的低18，冷藏3个月后则降低35。 d.接种量 一般一支高度为20 cm、直径为3 cm的试管斜面，丝状菌孢子数要求