生物化学--第十一章 DNA复制RNA转录-DNA复制.ppt

第十章 DNA的复制和修复,第一节 半保留复制 第二节 参与DNA复制的酶与蛋白质 第三节 复制过程 第四节 DNA损伤及修复,一、概念,以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,几个相关概念： 1. 复制起始点 (origin, ori) 原核生物只有一个复制起始点； 真核生物染色体DNA有多个复制起始 点，同时形成多个复制单位， 两个起始点 之间的DNA片段称为复制子(replicon)。,复制子,2. 复制叉 (replication fork) 复制时双链打开，分开成两股，新链沿 着张开的模板生成，复制中形成的这种Y 字形的结构称为复制叉。,二、实验依据,三、DNA复制的起点和方向,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 (Caims实验),四、复制特点 半不连续复制 半保留复制,DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,复制特点,第二节 参与DNA复制的酶与蛋白质,复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C dna X 相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C Dna X Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结 合并打开双链。,一、DNA聚合酶 （一）催化的反应特点 以四种dNTP为原料 需要模板 需要引物 催化反应方向为5-3 产物性质与模板链相同,（二）大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA 聚合酶,分子量 每个细胞的分子统计数 5-3 聚合酶作用 3-5 核酸外切酶作用 5-3 核酸外切酶作用 转化率,DNA 聚合酶,109，000 400 + + + 1,120，000 100 + + - 0 .05,400，000 10-20 + + - 50,比较项目,DNA 聚合酶,切除引物 修复,修复,复制,功能,1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）,DNA聚合酶 I,（1）5 3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3 5外切酶活性（在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）； （3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）；,5 3 聚合酶功能,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应机理：,DNA聚合酶的3- 5外切酶水解位点,3,5,DNA聚合酶3- 5外切酶活力,切除引物、 切除突变的片段,DNA聚合酶5- 3外切酶活力,5- 3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,切除错配的核苷酸,DNA-pol I: 曾被称为复制酶(replicase) 含量最多 可被水解成两个片段 小片段(N端)：具有53外切酶活性； 大片段(C端)：具有聚合活性和35 外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。,DNA-pol III: 由10种亚基组成的不对称聚合体 催化效率最高,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,DNA聚合酶全酶的亚基组成,Arthur Kornberg 1918,Stanford University Stanford, CA, USA,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959,“for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid“,二、解旋酶（解超螺旋，也叫拓扑异构酶、DnaB蛋白）,拓扑异构酶： 催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶， 在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。,DNA的超螺旋结构（原核） 二级结构为闭环双螺旋；三级结构为超螺旋,连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 扭转数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示 超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W）,L=T+W,三、解链酶（ DnaA蛋白） 四、SSB 五、引物酶 六、DNA连接酶,解螺旋/链 酶 (helicase) （ DnaA蛋白） : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确 配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供 能，解开DNA双链。,四、SSB,SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。 SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制中维持模板处于单链状态。,引物酶 (primase): 依赖DNA的RNA聚合酶。 催化RNA引物的合成。 在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物。 RNA引物： 在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA 聚合提供3-OH末端。,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。,第三节 复制过程,一、复制起始 二、链的延长（冈崎片段的合成） 三、复制的终止,一、复制起始,1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。 3、在类组蛋白（HU、ATP参与下, Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。 4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。,起始复合物,前引发复合物,开链复合物,引发体 (primosome): 是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板DNA上。,二、链的延长（冈崎片段的合成）,真核生物的冈崎片段为：100-200bp 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp,冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:,引导链与随从链分别由哪些酶或蛋白参与？,三、复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,DNA忠实性的保障,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。 2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。 3、复制中的即时校读功能。,真核细胞内有五种DNA聚合酶,真核和原核DNA细胞复制比较,真核细胞DNA复制的特点, 多个起点复制,端粒酶（telomerase）,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,特点： 1. 由RNA和蛋白质构成的复合物 2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为 模板逆转录合成端粒DNA 功能： 合成端粒DNA，维持端粒的长度,爬行模型：,端粒合成的一种模型,整合和杂交,第四节 DNA损伤及修复,四、诱导修复（SOS修复）,一、光修复,二、切除修复,三、重组修复,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于 损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚