灰黄霉素片微生物限度检查方法研究综述.doc

内蒙古医科大学文献综述题 目 灰黄霉素临床及微生物限度检查方法研究 学生姓名 邢丽霞学 号 200809011021 院 系 药学院专 业 中药学指导教师 崔晶华 高艳波二一二年五月四日灰黄霉素临床及微生物限度检查方法研究邢丽霞内蒙古医学院中药专业，呼和浩特 010059 摘要：灰黄霉素的临床应用为治疗包括头癣、体癣、股癣、手足癣等在内的表浅真菌病和深部真菌病，其不良反应主要有神经系统头痛消化系统不适过敏反应等。微生物限度检验误差的影响因素来自培养基设备计数误差、无菌室方面等，微生物限度检查方法验证的重点与应注意的问题及评价要求。关键词：灰黄霉素；微生物限度检查法；方法验证灰黄霉素为抗真菌类药物主要对毛发癣菌、小孢子菌、表皮癣菌等浅部真菌有良好抗菌作用。对念珠菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、孢子丝菌属、芽生菌属、球孢子菌属等无抗菌作用。该药系通过干扰真菌核酸的合成而抑制其生长。灰黄霉素是自灰黄青霉菌（Penicilli-um griseofulvum）的培养发酵液中提取制得的抗生素。因而对其进行微生物检查十分必要。微生物限度检查是判断药品受到微生物污染的程度，是对企业从原料到成品的生产全过程进行微生物评价的主要依据，也是药品安全性检查的重要项目。1灰黄霉素的临床应用与不良反应1.1灰黄霉素的临床应用 灰黄霉素作为一种低毒的抗生素，在早期主要用于治疗一系列的真菌感染引起的疾病，包括皮肤病、毛发病和藓病感染。它可以抑制具有壳质细胞壁的致藓真菌，可是对其它真菌、酵母菌、放射菌和细菌并没有作用1。1.1.1表浅真菌病1.1.1.1头癣目前灰黄霉素仍然是治疗头癣的首选药物，用最小剂量达到彻底治愈目的，灰黄霉素对各型头癣疗效均佳2。其中对黄癣和黑点癣的疗效更优于白癖。1.1.1.2体癣、股癣、手足癣 灰黄霉素治疗体癖、股癣疗效甚佳。股癣经治疗后， 若症状不能很快进步，应考虑其他因素，如多汗、擦烂、湿疹样变，或有细菌或念株菌感染等。手足癣应用灰黄霉素治疗，疗程较长，其疗程的长短常与手足癣侵犯部位的角化增厚程度有关。1.1.1.3甲癣 采用内服灰黄霉素与封包、削甲相结合的方法治疗多例甲癣，取得了显著疗效3。1.1.1.4叠瓦癖 应用灰黄霉素治疗叠瓦癣，疗程一般约30天可以痊愈。但有认为治疗叠瓦癣易复发，主张疗程宜较长。1.1.2深部真菌病 灰黄霉素对深部真菌体外实验无抑菌作用。临床上曾用以治疗白念珠菌病(包括由白念珠菌感染而致的鹅口疮和阴道霉菌病)，皮炎芽菌病，新形隐球菌病，球苞子菌病，黄色酿母菌病均无效。一般认为用灰黄霉素治疗抱子粽菌病疗效不比碘化钾为佳，且价格昂贵。因此，除非对碘化钾有过敏患者，一般不应用灰黄霉4。此外，灰黄霉素在治疗痛风也有很好的效果5，它的这种作用跟特异性的抑制多核白细胞的趋药性有关6。1.2灰黄霉素的不良反应1.2.1神经系统头痛较为常见，约10患者可出现头痛，初时较重，继续用药可减轻。其他尚有嗜睡、乏力等。偶有眩晕、共济失调和周围神经炎等发生。1.2.2消化系统少数患者可出现上腹不适、恶心或腹泻，一般系轻度，患者可耐受。其他也可见到念珠菌性口腔炎、腹绞痛等。1.2.3过敏反应 约3患者可发生皮疹、红斑等反应7。1.2.4毛囊口脱屑性反应 我们在35例头癣患者用药过程中，有30例于疗程后期出现毛囊口脱屑性反应，在黄癣患者很象鳞屑型黄癣病损，在白癣患者则很象病变加剧或复发，不加处理，历23月即可自行消退，这可能是由于该药在毛囊及其周围沉积较多，引起局部炎症反应所致8。1.2.5灰黄霉素对血液系统的毒性反应。临床常见白细胞减少，中性粒细胞减少，单核细胞增多，出现点状嗜碱性红细胞9。本品还能引起寒冷性荨麻疹及光敏感、血管神经性水肿等。2微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法10。检查项目包括染菌量及控制菌的检查，是评价生产单位所用的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、生产环境和操作者卫生状况的重要手段和依据11。微生物限度检查是判断药品受到微生物污染的程度，是对企业从原料到成品的生产全过程进行微生物评价的主要依据，也是药品安全性检查的重要项目。微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。微生物限度检查法验证的目的是确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。验证的内容包括准确性（回收率）、专属性。验证的类型分为前验证（建立微生物限度检查法时的验证）和再验证（修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证），根据检查方法的不同，又分为细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。2.1微生物限度检验误差的影响因素 生物检验法是目前微生物检测的首选法，但此法操作程序多，步骤繁杂，任何疏漏或非标准化的操作条件，均可导致测定结果的误差为了使检验结果反映药品的污染状况，下面就造成检验误差的原因及控制方法分述如下：:2.1.1培养基的影响12 培养基是培养检测细菌的营养制品，其质量的好坏稳定与否，对检验结果有极为重要的影响。多数厂家生产的干燥培养基一般质量较稳定，须按使用说明条件配制和存在规定的效期内使用，对初购的培养基应进行质量检查对自配培养基应测定其有效性及灵敏度。在更换配方成分时应进行质量检查。2.1.2 设备的影响 对各种器械及设备均应有定期检定与维修记录，以保证其正常使用。各种培养箱除定期计量认证外，于培养箱内置放最高、最低温度计，每天观察温度波动范围。玻璃仪器、容量仪器须校验，玻璃器械均应洗涤干净，不残留酸碱及抑菌物质。2.1.3 计数误差 在进行菌落计数时，应仔细观察。菌落生长小而密集，最易发生计数误差， 要仔细判断。勿漏计细小的、琼脂内和平皿边缘生长的菌落，同时应注意细菌菌落与供试品中颗粒、沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间57d，细菌菌落常会生长增大而容易鉴别。2.1.4 无菌室方面造成的误差 在需要进行菌种处理和微生物鉴别时，应在半无菌室进行，严禁在微生物检查用洁净室操作，否则，将会导致试验室环境污染或菌种之间的交叉污染13。2.1.5 被测药物性质的影响 供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。制备供试液时，力求均匀分散。因为测定中一个细菌可能繁殖成一个菌落，而一群也可能只形成一个菌落，测定时与匀质方式、条件关系极为密切，分散充分时，菌落生长数多，反之菌落数就少。2.1.6抽样 抽验部分样品推断整批药品的微生物质量，是药品微生物限度检验的基本任务。药品微生物检验不同于化学药品的含量测定，因为污染于药品中的微生物具有特殊性:第一，药典中以活的微生物作为检验对象。第二，分布的不均匀性。在一个批号内产品有的被污染，有的不被污染，分布不匀，在被污染的部分中，有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。这种不均匀性源于污染原的复杂性，有原辅料污染、工艺污染、空间污染和操作人员污染等等构成污染量的多少差异，形成不均态。再者，微生物具有族团性，族团大小、紧密程度是可遗传的，族团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。正因为以上这些特点，抽样方法、抽样数量、抽样次数等抽样状况很大程度上决定着检验的结果遵循随机原则的概率抽样可以保证抽选出代表性较高的样本，使样品具有代表性，保证样本推论总体的可靠性14。2.2微生物限度检查方法验证与评价15 从保证药品安全性的实际出发，不同品种需要选择建立各自适当的检查方法，包括仿制药。由于不同生产企业采用的工艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不同的抑菌特性，进行微生物限度检查时，具体的检查方法也不能简单地照搬，需要通过试验验证核实已有的试验方法和检测系统是否适用，因此，也需要进行必要的方法验证。2.2.1方法验证的重点2.2.1.1验证制成适宜供试液的前处理方法，证明方法对微生物生长、检出无影响。2.2.1.2验证样品有无抑菌性、抑什么菌、最敏感的菌是那一个，其结果将直接影响后续检验方法的选择和操作步骤的进行，同时是最终所选检验方法和操作步骤合理性的证明。2.2.1.3验证消除样品抑菌性的方法，证明方法的有效性及方法对污染菌生长无影响；如何选择合理、适宜、简单有效的消除抑菌性的方法是当前验证工作的关键。2.2.2方法验证中应注意的问题与评价要求2.2.2.1验证试验的完整性验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对最终试验结果的判断。故应按照中国药典2010 年版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时，既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组）。2.2.2.2试验操作方法 中国药典2010年版微生物限度检查法包括平皿法和薄膜过滤法。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，操作简单；全封闭的过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染，对试验结果可信性影响较小。故尽量采用全封闭的薄膜过滤法。2.2.2.3样品的前处理 样品的前处理可采用溶解、乳化、破乳、稀释、离心等方法，也可几种方法联用，但需说明采用的处理方法的理由，并证明所用处理方法对各试验菌的生长无影响。对非水溶性的供试品，如果溶解冲洗不完全，会影响试验结果；故应注意使用加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂和稀释剂，或用十四烷酸异丙酯处理油类供试品等。2.2.2.4方法的再验证 建立微生物学检查方法时必须进行方法学验证，以证明所采用的方法适用于该药品的生物学检查。如果产品的组分或原检验条件发生改变时，应考察改变对微生物生长的影响，并进行方法的再验证；目的是考察验证结果的稳定性并及时发现影响微生物生长的因素。2.2.2.5质量标准中【微生物限度】项下内容的撰写建立微生物学检查方法时必须进行方法学验证，并应将验证的方法描述在质量标准中【微生物限度】项下。不同处方工艺制剂的微生物学检查方法和检验条件不同，只有将经过验证确认可行的检验方法和检验条件完整描述在质量标准中，实验人员才能进行微生物限度检查操作。2.2.3对方法验证结果和验证报告的评价 通过所报的敏感菌来验证检查结果的可靠性。首先应按给药途径确定品种应符合无菌检验还是微生限度检查，确定验证项目。如应进行微生物限度检查，确定该品种规定的微生物限度标准，再确定应验证哪些项目。样品的前处理方法应合理，并有采用方法不影响微生物生长的证据。对供试品的抑菌性、抑什么菌、最敏感菌是那个，应有依据或试验结果来证明；如证明供试品有抑菌性，应验证所选消除抑菌性方法的合理性和有效性。判断经验证所确定的检验方法和试验条件是否能满足最敏感菌的要求。2.3小结 中国药典2010年版及以前的版本虽然收载了微生物限度检查法，但仍需明确对检验方法进行必要的方法学验证。2010年版中华人民共和国药典收载了药品微生物限度检查法，但随着应用，存在着影响药品微生物限度检验导致结果误差因素，在今后的检验中我们在进行药品微生物限度检验时应严格无菌室消毒管理，对检验中所有使用的器具进行彻底灭菌处理，重视培养基质量和供试液制备过程的影响，评估被测药物性质对检验结果的准确性影响调整检测方法，认识和防止菌落计数误差；消除误差影响因素，以减少和防止药品微生物限度检验误差的发生。灰黄霉素为抗真菌类药物主要对毛发癣菌、小孢子菌、表皮癣菌等浅部真菌有良好抗菌作用，临床应用较好，且不良反应发生率低，安全性高；经验证的微生物限度检查方法能很好的检验产品的受污染程度，有效的保证了产品的质量。参考文献1Dasu V V，Panda T，Chidambaram M.Determination of significant parameters for improved griseofulvin production in a batch bioreactor by T aguchis metho d JProcess Biochem，2003，38:877-880.2雷光烈，孙辅君，张栓紧. 灰黄霉素治疗257例头癣观察报告J.河南医药.1980(01)3李玉莲. 灰黄霉素加削甲治疗手、甲癣84例J.人民军医.1995(08)4吴绍熙 谢晶辉灰黄霉素的合理应用江苏医药 1977年 第04期5Bandman U， Norberg B， Simmingskld G. 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