旋覆花中化学成分及其活性研究.docx

旋覆花中化学成分及其活性研究旋覆花中化学成分及其活性研究 中国药典2010年版收录的旋覆花为菊科植物旋覆花属旋覆花Inula japonica Thunb.或欧亚旋覆花I. britannica L.的干燥头状花序，作为传统的中草药主要分布在欧洲、非洲及亚洲的中国、韩国和日本1-2，以地中海地区为主，在我国有20 余种。目前，国内外学者报道了旋覆花中富含甾醇、倍半萜及黄酮类化合物，药理研究结果表明，旋覆花属植物在抗肿瘤4-6、抗炎、抗血脂和护肝、及预防和治疗糖尿病等方面都具有很好的生物活性。本文对河南产旋覆花I.japonica 开展了活性化学成分研究本文由收集整理，从中分离得到15个化合物，利用有机波谱技术鉴定其化学结构，分别为二氢芥子醇（1），（3S，5R，6S，7E）-5，6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one（2），（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one（3），阿里二醇（4），蒲公英醇乙酸酯（5），8，9，10-三羟基百里香酚（6），花旗松素（7），木犀草素（8），泽兰黄酮（9），泽兰黄醇素（10），菠叶素（11），槲皮素（12），对羟基桂皮酸（13），咖啡酸（14），咖啡酸乙酯（15）。进一步考察了以上化学成分对肥大细胞LTC生成、脱颗粒及巨噬细胞NO释放的影响。 1 材料 Bruker AV 400核磁共振仪（TMS内标）；液质联用色谱仪：Alliance 2695 Quattro Micro TM ESI（Waters）；半制备高效液相色谱仪：日本分光公司（JASCO）， PU-2089（泵），RI-2031及UV-2075（检测器）；制备HPLC色谱柱：GPC（凝胶渗透色谱柱） Shodex， Asahipak GS-20G（20 mm500 mm），YMC-Pack ODS-A SH-343-5（20 mm250 mm）， YMC-Pack S IL-06（ 20 mm250 mm， 5 μm）；凝胶柱色谱Toyopearl HW-40C（Tosoh）；日本Hitachi UV-3310型紫外-可见分光光度计；柱色谱和薄层色谱用硅胶均系青岛海洋化工厂生产，所用试剂均为分析纯；氘代试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞（韩国细胞株银行）；LTC ELISA试剂盒（美国Cayman Chemical公司）； KL（加拿大STEMCELL Technologies公司）；LPS（美国Sigma-Aldrich公司）；RPMI-1640，DMEM和胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司）。 旋覆花于2010年采集于河南，经天津医科大学药学院周晔教授鉴定为I. japonica，标本（D20110331） 存放于天津医科大学药学院。 总结大全 2 方法 2.1 提取与分离 旋覆花干燥头状花序8 kg，用75%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩，提取物（672 g）以水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取物（36 g）、乙酸乙酯提取物（117 g）、正丁醇提取物（266 g）。旋覆花乙酸乙酯提取物（117 g），以硅胶柱色谱分离，分别用石油醚-乙酸乙酯（41，31，21，11，12），乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇（955，91，82）梯度洗脱，TLC合并类似组分，得到组分XFH0101-0128。 组分XFH0112经过凝胶（Toyopearl HW-40）柱色谱分离得到5个组分（12.112.5）。组分12.3经制备高效液相色谱ODS分离（甲醇-水，73）和制备凝胶渗透色谱GPC（MeOH）纯化，得到化合物1（7.0 mg），2（7.5 mg），3（14.0 mg）。组分12.4进一步经制备高效液相ODS（甲醇-水，64） 纯化，得到化合物10（13.5 mg）。XHF0115经过凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离得到6个组分（15.115.6）。组分15.3和15.4分别经制备高效液相色谱（ODS-A，甲醇-水，64；GPC，甲醇） 分离纯化，得到化合物6（9.4 mg），11（55.5 mg）。XFH0111经过凝胶（Toyopearl HW-40）柱色谱分离，经制备高效液相色谱（GPC，甲醇） 纯化得到化合物7（13.4 mg），8（9.1 mg），9（38.7 mg），14（35.3 mg）。组分XFH0114（2.8 g）以凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离，进一步重结晶得到化合物12（300.0 mg）。XFH0109（2.8 g） 经过凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离，进一步经制备高效液相色谱ODS（甲醇-水，82） 和GPC（甲醇） 分离纯化得到化合物4（3.0 mg），5（8.6 mg），13（7.0 mg）。XFH0113（2.2 g） 经过凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离，进一步经制备高效液相色谱 GPC分离得到化合物15（5.0 mg）。 2.2 NO生成的测定 RAW264.7细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基。取对数生长期的细胞（310细胞/孔） 接种于24孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度（根据MTT法筛选的无细胞毒剂量） 各种单体化合物孵育1 h，再加入终浓度为200 μgL的LPS刺激24 h。Griess法测定上清中NO的含量。 2.3 LTC含量和肥大细胞脱颗粒的测定 来源于（BALB/c） 小鼠骨髓的肥大细胞（bone marrow-derived mast cells；BMMCs） 的制备按文献方法，BMMCs培养于含白介素-3（IL-3） 和10%FBS的RPMI1640培养基。BMMCs（210细胞/孔） 接种于96孔板中，加入不同浓度（根据MTT法筛选的无细胞毒剂量） 各种单体化合物孵育1 h，再用终浓度为50 μgL的KL刺激15 min后收集上清液。采用ELISA方法检测上清中LTC的含量；采用分光光度分析法定量β-hexosaminidase（β-HEX） 底物的水解作用，检测β-HEX的释放。 3 结构鉴定 化合物1 无色油状物；ESI-MS m/z 211M-H，400 MHz）δ：6.43（1H，s，H-2，6），2.65（2H，t，J=7.6 Hz，H-7），1.88（2H，m，H-8），3.69（2H，t，J=6.4 Hz，H-9），3.88（6H，s，-OCH，100 MHz）δ：133.0（C-1），105.0（C-2，6），147.0（C-3，5），133.0（C-4），32.3（C-7），34.5（C-8），62.3（C-9），56.3（-OCH）。以上数据与文献报道二氢芥子醇的数据基本一致。 化合物2 无色油状物；Ei-MS m/z 224（M，400 MHz）δ：7.03（1H，d，J=15.6 Hz，H-7），6.28（1H，d，J=15.6 Hz，H-8），3.91（1H，m，H-3），2.28（3H，s，H-10），1.19（6H，s，H-11，12），1.07（3H，s，H-13）；，100 MHz）δ：35.1（C-1），40.6（C-2），64.0（C-3），46.6（C-4），67.3（C-5），69.5（C-6），142.4（C-7），132.6（C-8），197.5（C-9），28.3（C-10），29.3（C-11），25.0（C-12），19.9（C-13）。以上数据与文献报道（3S，5R，6S，7E）-5，6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one的数据基本一致。 化合物3 无色油状物；EI-MS m/z 208（M，400 MHz）δ：5.93（1H，s，H-4），5.68（1H，dd，J=15.2，6.0 Hz，H-8），5.53（1H，J=15.2，8.4 Hz，H-7），4.35（1H，m，H-9），2.52（1H，d，J=9.2 Hz，H-6），2.33（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.07（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.90（3H，d，J=1.2 Hz），1.29（3H，d，J=6.4 Hz，H-10），1.03（3H，s，H-11），0.98（3H，s，H-12）；，100 MHz）δ：36.2（C-1），47.4（C-2），199.3（C-3），125.8（C-4），162.0（C-5），55.4（C-6），126.6（C-7），138.6（C-8），68.3（C-9），23.5（C-10），27.1（C-11），27.9（C-12），23.5（C-13）。以上数据与文献报道（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one的数据基本一致。 化合物4 白色无定形粉末；EI-MS m/z 442（M，400 MHz）δ：4.65（1H，d，J=1.9 Hz，H-30a），4.63（1H，d，J=1.9 Hz，H-30b），3.39（1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H-3），3.21（1H，dd，J=11.3，5.0 Hz，H-16）；，100 MHz）δ：38.8（C-1），27.4（C-2），79.0（C-3），38.9（C-4），55.4（C-5），18.3（C-6），34.0（C-7），40.0（C-8），50.0（C-9），37.1（C-10），21.4（C-11），25.9（C-12），38.8（C-13），42.3（C-14），36.1（C-15），77.3（C-16），40.9（C-17），47.7（C-18），39.0（C-19），153.6（C-20），25.0（C-21），35.3（C-22），28.0（C-23），15.3（C-24），16.3（C-25），16.3（C-26），15.9（C-27），12.8（C-28），25.3（C-29），107.4（C-30）。以上数据与文献报道阿里二醇的数据基本一致。 化合物5 白色无定形粉末；Ei-MS m/z 468（M，400 MHz）δ：1.02（6H，s，H-26，29），0.93（3H，s，H-27），0.87（6H，s，25-CHCO），4.48（1H，dd，J=10.4，6.0 Hz，H-3），4.62（1H，br s，H-30a），4.60（1H，br s，H-30b）；，100 MHz）δ：38.4（C-1），23.7（C-2），81.0（C-3），37.8（C-4），55.4（C-5），18.2（C-6），34.5（C-7），40.9（C-8），50.4（C-9），37.0（C-10），21.5（C-11），26.1（C-12），39.1（C-13），42.0（C-14），26.6（C-15），38.3（C-16），34.5（C-17），48.6（C-18），39.4（C-19），154.6（C-20），25.6（C-21），38.9（C-22），27.9（C-23），16.4（C-24），16.5（C-25），15.9（C-26），14.7（C-27），19.5（C-28），25.5（C-29），107.1（C-30），171.0（C-1′），21.4（C-2′）。以上数据与文献报道蒲公英醇乙酸酯的数据基本一致。 化合物6 无色油状物；ESI-MS m/z 199M+H，400 MHz）δ：7.16（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.54（1H，d，J=8.0 Hz，H-6），6.51（1H，s，H-2），2.18（3H，s，H-7），3.67（4H，m，H-9，10）；，100 MHz）δ：156.0（C-3），137.5（C-1），128.2（C-5），125.2（C-4），119.7（C-6），117.3（C-2），21.0（C-7）， 65.2（C-9，C-10），78.9（C-8）。以上数据与文献报道8，9，10-三羟基百里香酚的数据基本一致。 化合物7 浅黄色粉末；ESI-MS m/z 305M+H，400 MHz）δ：11.91（1H，br s，5-OH），10.86（1H，br s，7-OH），9.02（1H，br s，3′-OH），4.97（1H，d，J=11.2 Hz，H-2），4.50（1H，br d，J=11.2 Hz，H-3），6.75（3H，m，H-2′，5′，6′），5.91（1H，d，J=1.6 Hz，H-8），5.86（1H，d，J=1.6 Hz，H-6）；，100 MHz）δ：83.0（C-2），71.5（C-3），197.7（C-4），163.3（C-5），95.9（C-6），166.7（C-7），94.9（C-8），162.5（C-9），100.4（C-10），128.0（C-1′），115.3（C-2′），144.9（C-3′），145.7（C-4′），115.1（C-5′），119.4（C-6′）。以上数据与文献报道花旗松素的数据基本一致。 化合物8 黄色无定形粉末；ESI-MS m/z 309M+Na，400 MHz）δ：12.98（1H，s，5-OH），7.43（1H，br d，J=8.0 Hz，H-6′），7.40（1H，br s，H-2′），6.90（1H，br d，J=8.0 Hz，H-5′），6.67（1H，br s，H-3），6.45（1H，br s，H-8），6.20（1H，br s，H-6）；，100 MHz）δ：164.0（C-2），102.8（C-3），181.6（C-4），161.4（C-5），98.7（C-6），163.8（C-7），93.7（C-8），157.2（C-9），103.6（C-10），121.4（C-1′），113.3（C-2′），145.6（C-3′），149.6（C-4′），115.9（C-5′），118.9（C-6′）。以上数据与文献报道木犀草素的数据基本一致。 化合物9 淡黄色针状结晶（甲醇）；ESI-MS m/z 339M+Na，400 MHz）δ：13.1（1H，br s，5-OH），7.45（1H，br d，J=8.4 Hz，H-6′），7.42（1H，br s，H-2′），6.91（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.69（1H，s，H-8），6.58（1H，br s，H-3），3.78（3H，s，6-OCH，100 MHz）δ：163.9（C-2），102.4（C-3），182.0（C-4），152.3（C-5），131.3（C-6），157.2（C-7），94.1（C-8），152.8（C-9），104.0（C-10），121.5（C-1′），113.3（C-2′），149.6（C-3′），145.7（C-4′），116.0（C-5′），118.9（C-6′），59.9（-OCH）。以上数据与文献报道泽兰黄酮的数据基本一致。 开题报告 t 化合物10 黄色无定性粉末；ESI-MS m/z 383M+Na，400 MHz）δ：12.40（1H，br s，5-OH），7.69（1H，br d，J=8.4 Hz，H-6′），7.68（1H，br s，H-2′），6.96（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.55（1H，s，H-8），3.99，3.98，3.86（各3H，s，6，7，4′-OCH，100 MHz）δ：149.8（C-2），139.0（C-3），178.8（C-4），148.8（C-5），130.4（C-6），155.9（C-7），90.2（C-8），153.0（C-9），106.4（C-10），123.8（C-1′），115.6（C-2′），145.2（C-3′），145.5（C-4′），114.3（C-5′），121.6（C-6′），60.2（6-OCH）。以上数据与文献报道泽兰黄醇素的数据基本一致。 化合物11 黄色无定性粉末；ESI-MS m/z 369M+Na，400 MHz）δ：12.38（1H，br s，5-OH），9.54（1H，br s，7-OH），9.48（1H，br s，4′-OH），8.66（1H，br s，3-OH），7.59（1H，br s，H-2′），7.47（1H，d，J=8.4 Hz，H-6′），6.91（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.83（1H，s，H-8），3.91，3.78（各3H，s，6，3′-OCH，100 MHz）δ：148.8（C-2），137.5（C-3），178.1（C-4），148.6（C-5），129.5（C-6），155.7（C-7），90.8（C-8），154.5（C-9），105.5（C-10），121.0（C-1′），115.7（C-2′），145.2（C-3′），145.6（C-4′），115.5（C-5′），120.9（C-6′），59.6（3H，s，6-OCH）。以上数据与文献报道菠叶素的数据基本一致。 化合物12 黄色粉末；ESI-MS m/z 303M+H，400 MHz）δ：12.49（1H，br s，5-OH），10.79（1H，br s，3-OH），9.61（1H，br s，7-OH），9.38（1H，br s，3′-OH），9.32（1H，s，4′-OH），7.68（1H，br s，H-2′），7.54（1H，br d，J=8.4 Hz，H-6′），6.90（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.41（1H，br s，H-8），6.19（1H，br s，H-6）；，100 MHz）δ：146.9（C-2），135.8（C-3），175.9（C-4），160.6（C-5），99.3（C-6），163.9（C-7），93.6（C-8），156.4（C-9），103.2（C-10），122.2（C-1′），115.1（C-2′），145.1（C-3′），147.7（C-4′），115.3（C-5′），120.3（C-6′）。以上数据与文献20，21报道槲皮素的波谱数据基本一致。 化合物13 白色粉末；ESI-MS m/z 165M+H，400 MHz）δ：12.17（1H，br s，COOH），7.48（2H，d，J=8.8 Hz），7.41（1H，d，J=16.0 Hz），6.81（2H ，d ，J=8.8 Hz），6.28（1H，d，J=16.0 Hz）；，100 MHz）δ：127.0（C-1），130.8（C-2，6），116.8（C-3，5），161.5（C-4），146.4（C-7），115.2（C-8），170.4（C-9）。以上数据与文献报道对羟基桂皮酸的数据基本一致。 思想汇报 化合物14 白色针晶；ESI-MS m/z 203M+Na，400 MHz）δ：10.1310.28（3H，br s，-OH），7.44（1H，d， J = 16.0 Hz，H-7），7.05（1H，br s，H-2），6.97（1H，br d，J=8.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.20（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）；，100 MHz）δ：125.7（C-1），114.6（C-2），145.5（C-3），148.1（C-4），115.1（C-5），121.1（C-6），144.5（C-7），115.7（C-8），167.9（C-9）。以上数据与文献23-24报道咖啡酸的数据基本一致。 化合物15 白色片状结晶（甲醇）；ESI-MS m/z 231M+Na，400 MHz）δ：7.50（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.01（1H，br s，H-2），6.90（1H，br d，J=8.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.17（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），4.18（2H，q，J=6.8 Hz，H-1′），1.31（3H，t，J=6.8 Hz，H-2′）；，100 MHz）δ：167.9（C-1），114.0（C-2），145.1（C-3），127.2（C-4），115.2（C-5），146.9（C-6），146.9（C-7），115.3（C-8），122.2（C-9），60.6（C-1′），14.3（C-2′）。以上数据与文献报道咖啡酸乙酯的数据基本一致。 4 抗炎活性测定 4.1 各种化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响 利用Griess法测定RAW264.7细胞NO的释放量，在非细胞毒浓度下检测各化合物对NO的释放的抑制活性。化合物8，12与其他化合物相比显示出较强的NO生成抑制作用，而且其活性呈剂量依赖性，IC分别为24.5，26.5 μmolL。以L-N-（1-iminoethyl）lysine（L-NIL）dihydrochloride（诱导型一氧化氮合酶特异性抑制剂）作为阳性对照药。结果见表1。 4.2 各种化合物对KL诱导的BMM