植物钾离子通道的分子生物学研究进展.doc

植物钾离子通道的分子生物学研究进展 闵水珠 (浙江大学 生命科学学院， 浙江 杭州， 310029) 摘要 ： 钾离子通道是植物钾离子吸收的重要途径之一 。近年来 ， 已从多种植物或同种植物的不同组织器官 中分离到多种钾离子通道基因， 包括内向整流型钾离子通道基因( 如 OsAKT1， DKT1， Ktrrl ， KIl l ， KZM1， ZMK2 等) 和外向整流型钾离子通道基因(如 CORK ， PTOR K ， STOR K等) 。文章分别从结构、 功能以及相关基因等三 方面综述了关于植物钾离子通道的分子生物学研究进展， 并对应用生物工程技术改良植物的钾营养性状进 行 了讨论。 关键词 ： 钾离子通道 ； 结构 ； 基因 中图分类号 ： Q945； Q735 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 004 1 524(2005)03 01 63 07 T he progress on the m olecular biology of t h e K channels in plants M G Shui zhu ( Co e ge o f Li fe Science ， 慨Un ive rsity ， Ha hou 310029 ， China ) A bstract ： Tif s review summar i zed recent progresses on molecular biology of K channels in plants ，including structure and their elevant genes in specialty The latter is d i v i ded into inward-rectifying K channel(K in) genes(OsAKT 1， DKT1， KFrl ， KDC1， KZM1， ZMK2， etc ) and o utward- tifyin g K channel(K out) gene s (C O R K ， FIDR K ， STOR K ， etc ) The possibilit y of impr o v i n g potassium nutr i tion of pla n t by bioengineerin g is also d i scussed in this paper K ey words ： K channel；structure ； gene 离子通道 (ion channe1) 是跨膜蛋 白， 每个蛋 白分子能以高达 l08个 秒的速度进行离子的被 动跨膜运输 ， 离子在跨膜电化学势梯度的作用下 进行的运输 ， 不需要加入任何的 自由能。一般来 讲 ， 离子通道具有两个显著特征 ： 一是离子通道 是门控的 ， 即离子通道的活性 由通道开或关两种 构象所调节 ， 并通过开关应答相应的信号。根据 门控机制 ， 离子通道可分为电压门控 、 配体门控、 压力激活离子通道。二是通道对离子的选择性 ， 离子通道对被转运离子的大小与电荷都有高度 的选择性。根据通道可通过的不同离子 ， 可将离 子通道分为钾离子(po tassium ion， K )通道 、 钠离 收稿 日期12005 01 25 作者简介： 闵水珠( 1950 一) ， 女 ， 浙江湖州人 ， 主要从事植物化学 研究。 子 (natrium ion， Na )通道 、 钙离 子 (calcium ion， Ca2 )通道等。其中 ， K 通道是种类最多 、 家族 最为多样化的离子通道 ， 根据其对 电势依赖性及 离子流方向的不同， 可把 K 通道分为两类 ： 内 向整流型 K 通道(inward rectif i er K channel ； K in) ， 外 向整流型 K 通道 (outward rectif i er K channel； K out) 。 K 是植物细胞 中含量最 为丰富的阳离子 ， 也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子 ， 它在植物生长发育过程中起着重要的作用 ， 具有 重要的生理功能。植物中可能存在 K 通道 ， 这 一点早在 20世纪 6o年代植物营养学界就有人 提出， 而一直到 80 年代才被 Schro eder 等人23证 实 ， 他们利用膜片钳(patch chmp)技术 ， 首先在蚕 豆( V c afaba )的保卫细胞中检测出了 K 通道 维普资讯 164 浙江农业学报第 l7 卷 (2O 05) 的存在。后来 ， 人们又陆续在其它植物及细胞中 发现了多种类型的 K 通道。 1 钾离子通道的结构 单个钾离子通道是 同源 四聚体 ， 4 个亚基 (subu nit)对称的围成一个传导离子的中央孔道 (p ore) ， 恰好让单个 K 通过。对于不同的家族 ， g 4 亚基有不 同数 目的跨膜链 ( m embrane。 span。 ning elem ent)组成。两个跨膜链与它们之间的 P_ 回环 ( p o r e helix loop) 是 K 通 道 结 构 的标 志 (2TM P) ， 不同家族 的 K 通道都有这样一个结 构。电压门控 K 通道在 2TM P 之前有 四条跨 膜链 (Sl S4) ， 使得通道具有感受并响应膜 电位 的能力(sensor) 。S4跨膜链每隔两个残基就有一 个带正电荷的精氨酸或赖氨酸 ， 其他位置都是疏 水性残基 ， 正是这些特殊结构使得 S4 片段在 门 控过程中起着重要的作用(图 1)。 目前从植物体中发现的 K 通道几乎全是电 压门控型的， 如保卫细胞 中的 K 外 向整流通道 等 ， 其结构模型如图 2 一a 所示。离子通透过程 中离子的选择性主要发生在狭窄的选择性过滤 器(s e lectivity filter)中(图 2一 b) ， X 射线晶体学显 示选择性过滤器长 1 2 nIll ， 孔径约为 0 3 n Ill， K 很多钾离子通道亚基都由6 个跨膜链组成( s1S6) ， 其中 s5、 S6 之间的多肽链属于孔道区， sl S4 是电压敏感 区( Sensor) ， S4 上的一 些特殊结构使其在电压门控中起到特殊作用 。 图 1植物钾 离子通道亚基结构示意图 F ig 1 Sketch map of potassium channel of subunits structures in the plant (a) (a)图中只标出直径上对置的两个亚基(tw0 d iametrically opp osite su bmits) ， 每个亚基上 的 P 回环形成狭窄的选择性过滤器(selectivity f i lter)， 在其胞内侧， 细胞膜的中间， 是一个中I ,e (cav i ty)。(b)选择性过滤器结构示意图， 过滤器中每一个亚基都存在一个保守的 TVGYG序列 (图中蓝色部分)， 图中绿色圆球为4 个钾离子的结合位点(1 4) ， 红色小球则为形成结合位点的氧原子。 图 2电压门控钾 离子通道结构示意图(根据 Jacquehne等改编) F ig 2 Sketch m a p of p o tassiu m channel structures 维普资讯 闵水珠等： 植物钾离子通道的分子生物学研究进展 165 脱水后(直径约为 0 26 nm)恰好可以通过。过滤 器中每一个亚基都存在一个保 守的 TVGYG 序 列 ， 每一个序列氨基酸上的羰基氧原子都指向孔 道。每 8 个氧原子以一个近似方形棱镜的形式 包围成 一 个 K 适 宜 的结 合 位点 ( ion binding site) ， 过滤器中存在 4 个这样的位点。前面第 1 3 个位点处于细胞外侧 ， 由8 个 TVGYG 序列氨 基酸上的羰基氧原子组成 ， 第 4个位点处于最靠 近细胞内侧的位置 ， 由 4 个羰基氧原子和 4 个侧 链苏氨酸上 的羟基氧原子组成_ 45 J。K 通道一 个独特的结构特征是孔道 内有一个部位可以膨 胀到 1 0 nln， 称为中心腔(cavity) ， 位于选择性过 滤器的胞内侧 ， 细胞膜的中间。中心腔中可以容 纳一个 K ， 其他空间则充满了水。另外 ， 通道胞 外侧的出口处存在两个 K 适宜的结合位点。 2钾离子通道的作用 有关 K 通道在植物体 内的作用研究并不 多。从 目前的结果来看 ， 认为主要是与 K 吸收 和细胞中的信号传递 (尤其是保卫细胞 )有关。 小麦根细胞中过极化激活的选择性内流 K 通道 的表观平衡常数 Km值为 8 8 mm ol L， 与通常的 低亲和吸收系统 Km 值相似 。近年来 ， 大量 K 通道基因的研究表明， K 通道是植物吸收转 运钾离子的重要途径之一。保卫细胞 中气孔的 开闭与其液泡中的 K 浓度有密切关系。质膜去 极化激活的 K 外 向整流通 道引起 K 外流 ， 胞 质膨压降低 ， 导致气孔的关闭。相反 ， 质膜上 H ATPase激活的超极化 (hyperpolarization)促使内向 整流钾离子通 道 (K in) 的打开 ， 引起 K 的内 流 ， 最终导致气孔 的张开_】 引 。可见钾离子通道 在保卫细胞开闭的过程中具有传递信号的功能。 3 钾 离子通道 相关基 因及其功 能 特征 迄今 ， 已从多种植物或同种植物的不同组织 器官中分离得到多种 K 通道基 因( 图 3) ， 根据 对其结构功能和 DNA 序列的分析 ， 可以把它们 分为 5 个大组 ： 工， ， 组基因属于内向整流型 通道 ； m组属于弱内向整流型通道(weakly inward rect er channels) ； V 组则是外向整流型通道坨 J。 下文中我们将分别 阐述各组基 因在近年来 的研 究进展。 3 1 内向整流型钾离子通道(K in)基因 内向整流型钾离子通道基因包括四组 ， 即组 工(AK T1 组 ) 、 1 I (KAT1 组 )、 IlI (AK T2 组 ) 、 IV(AtKC1组)。 其中 AKT2组为弱内向整流型钾 离子通道。 3 1 1 AK T 1 组 AKT1组基因主要包括 AKT1， LK T1， ZMK 1， OsAKT 1， DKT1等， 现介绍如下： AKT1(Arabidopsis K Transporter 1) 是第一 个克隆到的植物 K 通道基因， 采用酵母双突变 体互 补法从拟南芥 cDNA 文库 中筛选 出来 。 cDNA 序列分析表 明， AKT 1长 2 649 bp， 其 中的 阅读框为 2 517 bp， 编码 838 个氨基酸残基组成 的多肽 ， 相对分子质量约为 95 400 Da。 AKT 1编 码的 K 通道， 对 K 有极高的选择性 ， 其选择性 依次是 K Rb Na Li 。Norther n blot 分析表 明， AKT1组织特异性较强 ， 主要在根组 织中表达。用 GUS 报告基因发现， 除了成熟根 的表层细胞 以外 ， 在 叶原基细胞和水孔 中也存 在_8 J。近来研究发现 ， AKT 1通道不仅能促进植 物对土壤中 K 的吸收 ， 还能影响根细胞的生长 发育， 当把一 aktl 突变体植株幼苗 ( aktl m utant seedling)置于低外界 K 浓度时 ， 其根毛会萎缩 得非常dx 9J。 LK T1 是 从 番 茄 (Lycopersicon esculentum Mil1 )根毛特化的 cDNA 库 中克隆出来的。RNA 印迹分析表明， LKT1 的 m RNA 在根毛中强烈表 达， 很可能参与植物 K 的吸收。LKT1 编码 的多 肽中有 97 的氨基酸序列与马铃薯的 SKT1 一 致 ， 它们在功能上的相似性已经在一个电生理学 实验中得到了证实_】 。 ZMK 1( Zea m ays K channel 1)是从玉米胚 芽鞘 中分离出的 K 通道基因， 在皮层表达。在 卵母细胞中的表达表 明， ZMK1 编码 的 K 通道 是通过外部酸化激活的【 1 1 J。有研究表 明， 蓝光 对 ZMK 1通道在玉米胚芽鞘 中的分布有一定影 响3 2l。 OsAKT 1来源于水 稻( Oryza sativa L )特化 的 cDNA 库， Norther n blot 分析 表 明 OsAKT 1主要 维普资讯 166 浙江农业学报第 17卷(2oo5) 植物钾离子通道基因分五组( I 、 、 、 、 V )， 图中 I 、 、 组虚线框定区域为内向整流型钾离子通道(in ward retiiier K channels) 基因， 组框定区域为弱内向整流型钾离子通道(weakly inw ard rectifier K channe1)基因， 外向整流型钾离子通道(o utward rectif i er K cllallJlds)基因则在图中的V 组区域内。 圈3植物钾离子通道基因系统树(根据 Elide 等6 】 文改编) 3 Gene system tree of K channel 】 在根组 织 中表达 ， 叶片组 织上也 有少量表 达。 OsAKT1 的表 达具 有 明显地 细胞 特异 性 ( cell specif i city) ， 比如在根组织中， 其在表皮和内皮层 细胞中强烈表达， 而在脉管系统和外皮层细胞 中 表达量则要低得多【 3 0。最近研究表明，OsAKT1 似乎在盐胁迫下水稻的K 吸收过程中扮演重要 的角色【 3 1 J。 DKT1 是 最 近 由 Elide 等 人 从 胡 萝 卜 ( Daucu s carota) 中分离 出来的一种 a 亚基类的 K 通道基 因。DKT1基因长 2 827 bp， 其中阅读 框含有 2 622 个核苷酸， 编码由 873 个氨基酸组 成的多肽， 相对分子质量约为 99 000 Da。它与 拟南芥的 AKT1有 82 的同源性 ， 与 LKT1则有 85。 DKT1能在成熟胡萝 卜 中的叶片大量表达， 在根部 、 子叶、 茎等很多部位也有表达 ， 可能在植 物营养物质吸收和其他一些生理过程方面发挥 重要作用L 6 J 。 3 1 2 1 组 KAT1组基因编码内向整流钾离子通道 ， 其 与 AKT1 组基 因产 物结 构上 的最 大 区别是 在 COOH 端没有锚蛋 白相关 区 ( 枷n related do main，ANKY )。KAT1 组基 因 主要 包 括 KAT1， KST1， SIRK ， KZM1， KPT1等。 KAT1( Arabidopsis inward rectif i er K channel 1)是与 AKT1同时从拟南芥 cDNA 文库中筛选 出 来的植物 K 通道基 因【 1 3J。KAT1基因的阅读框 含有 2 031个核苷酸 ， 编码 的多肽由 677 个氨基 酸残 基 组 成， 相 对 分 子 质 量 约 为 78 000 Da。 KAT1的表达具有组织特异性 ， KAT1在拟南芥植 株中的主要表达部位是保卫细胞 ， 在根和茎中也 有少量的表达。 人们认为 KAT1通道可能参与了 气孔开放 ， 并向维管组织中转运 K ， 而不是直接 从土壤 中吸收 K+【 J。以 KAT1为探针 ， 又能从 拟南芥 cDNA 文库中筛选 出 KAT2 等功能类似的 内向整流型 K 通道基因。 KST1是以KATI 和 AKTI 作为探针从马铃薯 ( Solanum tuberosum L ) 的 cDNA 文库 中筛选 出 来的。它长约 2 381 bp， 可编码 689个氨基酸残 基的多肽。以 KST1 为探针 ， 与马铃薯 的绿花 蕾、 展开的花、 叶片、 表皮、 茎节、 块茎和根的各部 维普资讯 闵水珠等： 植物钾离子通道的分子生物学研究进展 位 RNA 进行杂交分析 ， 发现 KST1主要在花和叶 部位表达， 而在茎节、 块茎和根中不表达。 原位杂 交的结果还表明， KST1基 因产物主要存在于气 孔的保卫细胞中参与气孔的开闭。 SIRK 是 Pratelli 等-1 J人从葡萄藤植物 ( Vitis vinif era) 中分离出来的一种 K 通道基因。基因 表达的结果表明 ， SIRK 所显示 的功能特 性与 KAT2很相似。 通过将 SIRK 的启动子区与 GUS 报 告基因整合后在葡萄藤和拟南芥 中的表达 ， 分析 发现 ， SIRK 在葡萄藤保卫细胞中表达， 在拟南芥 的木质部薄壁组织也有表达。 KZM 1(K channel Zea m ays 1) 是来源于玉 米的一种内向整流型 K 通道基因， 主要表达在 玉米 的保卫细胞 和脉管系统 (vasculature) 等部 位 。单从 DNA 序列分析来看 ，KZM1通道很可 能与拟南芥的 KAT2具有相似的功能 ， 但与KAT2 相比， KZM1通道缺少分布在细胞膜外局部 的组 氨酸 ，因此 它 不 会 受 到 外 部 环 境 酸 化 的影 响1 8 。 1 ( K transporter Populustremula 1) 是 Hedrich 等从白杨中分离得到的 K 通道基因， 主 要表达在保卫细胞和芽部位。其基因产物在保 卫细胞开启和芽生长时 的 K 吸收过程 中起作 用 3 3l。 3 1 3 A K T2 组 AK T2 组 基 因 包 括 AKT2， ZMK2， VKC1， SPICK 1， PTK2， SKT2等 ， 编码弱内向整流型钾离 子通道。 与 AKT 1组通道一样， C 端也具有 ANKY 结构。 近年来 ， 关于 AKT2 组 的研究主要集中在 AKT2 与 ZMK 2 上。 AKT2是利用 AKT1作探针， 从拟南芥 cDNA 文库中得到的克隆 ， 同时被分离 的还有 AKT3， AKT4 等。 AKT2 基因编码由 802 个氨基酸残基组 成的多肽 ， Mr 约为 91 300 Da， 它与 AKT1， KAT 1 有 6o同源性 ， 能在 卵母细胞中表达并具有转 运 K 的作用。 AKT3 可能是 AKT2 的一部分 (缺 失头 15 个密码子)。在卵母细胞 中的表达表明 它们都是电压门控的内向整流 K 通道-l9 。 跟 ZMK 1一样 ， ZMK2 也是从玉米胚芽鞘中 分离的 K 通道基因， 在脉管系统表达。卵母细 胞 中的表达表明， ZMK2 依电压独立性及质子禁 止性通道方式调节 K 电流【 1 8。 3 1 4 AtK C 1 组 AtKC1组 基因产物无 ANKY 结构 ， 主要 有 A 1和 KDC1两种。 AtKC1( A thaliana K Channel 1) 是 Rein tanz 等从拟南芥 中分离克 隆的一个 a 亚基类 K 通道基因。研究表明， AtKC1 主要在根毛区 和根的内皮层表达。通过反 向 PCR 和膜片钳技 术研究发现 ， AtKC1通道的a一 亚基是根毛钾离子 吸收通道的重要组成单位。 KDC 1 (K channel of Daucus Carota 1) 是从 胡萝 卜 根 中分离和克隆出来的， 它属于植物 内向 钾离子通道的一个新亚族。通过原位杂交实验 显示 ， KDC1在胡萝 卜 根毛细胞中有高水平的表 达 ， 和它的拟南芥 的 AtKC 1具有很相似的表达方 式。 KDC1 不能单 独在卵母细胞 中表达 ， 即不具 功能性 。但 当其与 DKT1共同在卵母 细胞 中作 异源表达时， 它们的基 因产物能介导 K 流的产 生1 2， 。 3 2外向整流型钾离子通道(K out)基因 K out 通道存在于植物的各类细胞中， 它在 细胞膜去极化 (depolarization) 的条件下被激活打 开， 此时跨膜电势 比较高， 导致 K 由胞内排出到 胞外。 KCO1是第一个从植物细胞中筛选 出的具 有外向整流性的 K 通道基 因。 KCO1 是以 Shak el-通道的 P 回环的保守序列为探针 ， 从拟南芥的 EST 数据库中筛选 出的。它具有 2 个 P 回环 、 4 个跨膜链 (片段) 。KCO1能够向外转运 K 并且 依赖于胞质中的钙离子(Ca2 )。KCO1不仅能在 叶片和花中表达， 也能在幼苗 中表达 ， 但表达较 低 。 从拟南芥中， 人们还分离克隆了外向整流型 K 通道基因 SKOR。 SKOR 是拟南芥去极化激活 的 K 通道， 己经在卵母细胞 中得到表达， pH 变 化可以调节活化的通道数量。SKOR 对于 pH 的 敏感在生理范围内说 明， 内外 pH 在调节 K 分 泌到木质部时起作用【 。 CORK ( guard cell outward rectifying K chan ne1 )来源于拟南芥 的保卫细胞中。当在卵母细 胞 中异源表达时， GORK 的基因产物可以介导去 极化激 活的 K 流。拟南芥 的 SKOR( Stelar K o utward rectif i er)和 GORK 有 73 的同源性 ， 雨树 维普资讯 浙江农业学报第 l7 卷(2oo5) (豆科植物 Sam anea saman) 的 sP俐 r ( Sam anea saman Pulvinus outward rectifying K cha nne1) 与 CORK 有 75 的序列同源性 J 。 C O R K与SKOR 、 PTOR K( Populus Tremula outward fectifying K channe1) 、 SPORK 等共同组成了植物钾离子通道 家族的一个亚科( subfam ily) 。 4 展望 几十年来 ， 人们对植物吸收钾离子的机制进 行了较为深入的研究 。尤其是 Epstein0 J等的开 创性工作， 他假定 K 吸收可以用经典的酶动力 学来描述。并将 K 吸收分 为两个系统 ： 系统 I 指 K 吸收服从 Michaelis。 Menten 动力学， 并在低 外界 K 浓度(0 0010 2 m rno i L)下起作用 ， 又 称高亲和性(h础 af inity)吸收系统 ； 系统 则在 高的外界 K 浓度 ( 110 mm ol L)下起作用 ， 又 称低亲和性(1 o w af init y )吸收系统。低亲和性吸 收系统主要是通过 K 通道来进行 的。因此 ， 钾 离子通道是植物吸收钾离子的重要途径之一。 目前人们已经从植物中克隆出多个编码 K 通道的基因， 而且对这些基因的分子结构 、 功能 表达、 影响因素以及它们在植物 K 吸收(植物钾 营养 )中的作用等进行了很多研究。这些研究成 果为进一步利用生物工程技术改 良植物的钾素 营养和培育钾高效利用 型作物新品种奠定 了基 础 。 通过基 因工程技术 ， 人们 已相继开展 了将 KATI 和 AKTI 基因导人到拟南芥 、 烟草和水稻 的 研究 ， 并获得 了一些 转基 因植株。比如， 施卫 明【 28等利 用 根 癌农 杆 菌 介 导法 已成 功地 把 KAT1和 AKT1 导人拟南芥和野生型烟草 中， 并 获得了转基因植株及其纯合株系， 发现转基因植 株的吸钾速率和对 K 的累积能力都比对照的有 明显 的提 高， 而 且， 经过 分 子检 测 ， 也 证 实 了 71 1和 AKT1基因在转基因植株中得到了整合 和表达。最近 ， 有科学家应用花粉管通道法将高 钾植物空心莲子草 DNA 导入到水稻中， 在后代 的大量筛选 中也发现一些株系的吸钾速率和对 K 的累积能力 比相对应的受体有 明显 的提高； RAPD 检测也表 明外源 DNA 的导人 引起 了受体 植物基因组 的改变。这些研究工作表 明应用分 子育种手段 和基因工程技术完全有可能将钾离 子通道基因转入到植物中去 ， 使其在转基因后代 中表达 ， 从而达到改 良植物的营养性状的 目的。 因此 ， 运用现代分子生物学手段和基因工程 技术筛选高效利用钾的作物 品种或利用现有的 钾离子通道基 因改 良作物品种 ， 从 而提高作物 本身的钾吸收利用能力应该是 目前主要的研究 方向。可以相信 ， 随着分子生物学技术 、 基 因工 程技术和有关分析测试技术的发展和应用。随 着研究工作的不断深入， 有关钾离子通道基因的 分离 、 克隆和利用会取得更大的进展。 参考文献 ： l 1 J Langer K ， Ache P ， Geiger D， et a 1 Polar potassium alIspc lners capable of controlling K hom e c tasis and K 一 dependent 圳0gm esislJ J ，The Plant J ournal ， 2O O 2， 32： 997 1009 2Schroeder JI，Hedrich RPotassium -sele c tive sin gle channels in gu ard cell pro to plasts o f Vicia b a J nature， 1984， 312： 361 363 3 J Jacqueline MG ， Declan AD Potassium channel structu res： do they co m fo rmJ Curren t Opinion in Structural Bi ology， 20O 4， 14： 440 446 14 J Mackinnon R ， Zhou YF The occupancy o f ions in the K sele c ti vity f i lter ： ch se balance a n d coupling of i on binding to a protein co nfo rmatio na l ch a n ge u ndedie hish con ductio n rate s J J MB ， 2003 ， 333 ： 965 975 5Mackinno n R， Zho u MA m utant KcsA K channel w it h altered c o nduction pro perties a n d s elect i vity f i lter 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