乙肝五项梅毒的检测及应用（精减）课件

乙肝五项、梅毒螺旋体抗体的检测及应用,孕前优生健康检查临床检验操作技术培训,河南省人口和计划生育科学技术研究院,免疫层析快速检测技术,历史： 放射免疫测定 1960 酶免疫测定 1970 荧光免疫测定 1980-1990 化学发光免疫测定 1990 膜固相免疫测定 1990,原理,将特异的抗原（或抗体）先固定于固相膜的某一区带，当该干燥的固相膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有经过标记的抗体区域时，样品中相应的抗原即与该标记抗体发生特异性结合，抗原抗体复合物移动到特定区域被捕获，使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。,特点： 快速 简便 可单份检测 稳定性好 检测种类多 可测定物质范围广,不足之处 敏感度略低，价格略高（与ELISA比） 不易制备定量、半定量试剂 质量控制困难,免疫层析快速检测试剂结构图,免疫层析快速检测常用的结合物,胶体金 乳胶颗粒,胶体金,也称金溶胶，是由金盐还原形成的金颗粒悬液。 由一个基础金核及包围在外的离子层构成。呈球形（小颗粒）或椭圆形（大颗粒）。 对电解质敏感，对试验有影响。 呈色性：胶体金的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。,固相膜种类,玻璃纤维素膜 尼龙膜 聚偏氟乙稀膜 硝酸纤维素膜 固相NC膜,固相膜特点,多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附 高度敏感性 抗原或抗体 易于漂洗 操作简便,免疫层析快速检测技术分类,双抗体夹心法测抗原 间接法测抗体 双抗原夹心法测抗体 竞争法测抗体,操作步骤,试剂盒先恢复室温，从原包装铝箔袋中取出试剂盒，在1小时内尽快地使用。 将试剂盒置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直滴加3滴（100微升）无气泡的血清/血浆于试剂盒的加样孔内。 等待紫红色条带的出现，测试结果应在15分钟内读取。20分钟后判断无效。,结果判断,夹心法 结果判断 竞争法 结果判断,质量控制,应避免样品溶血。溶血、粘稠及高脂标本可能会导致检测结果不稳定。 实验环境应保持一定温度，避风。避免在过高温度下进行实验。 试剂从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。 试剂若为室温应注意防潮；若低温下保存应平衡至室温方可使用。 滴加试剂时，应先摇匀，并弃去12滴，垂直滴加。 此方法为初筛，因此阳性结果须用其他方法（如EIA）进一步确认。,乙肝五项的检测及应用,1.乙肝五项的各项简述 2.乙肝五项各项的临床意义 3.乙肝五项32种可能组合 4.乙肝五项检测的影响因素 5.乙肝五项检测标准化操作,乙肝五项,乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 乙肝病毒表面抗体（抗-HBs） 乙肝病毒e抗原（HBeAg） 乙肝病毒e抗体（抗-HBe） 乙肝病毒核心抗体（抗-HBc）,乙肝五项的各项简述,1HBsAg 血清中检出HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一，出现于患者血清转氨酶(ALT)升高前28周，至恢复期HBsAg滴度逐步降低乃至消失，抗HBs出现。有部分患者HBsAg在血清中可持续存在,是因肝细胞仍在不断地复制HBsAg。,HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg. 但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。 目前国内最常用的HBsAg免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)，其次是放射免疫试验(RIA)。,2抗HBs 当乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，这种特异的免疫球蛋白G，就是表面抗体。它可以和表面抗原特异地结合，然后在体内与人体的其他免疫功能共同作用下，可以把病毒清除掉，保护人体不再受乙肝病毒的感染，故称表面抗体为保护性抗体。一般成人期感染乙型肝炎病毒，可以发生急性乙型肝炎，也可没有症状，绝大多数在36个月以后才出现表面抗体。检查出抗-HBs阳性，疾病即已逐渐恢复。,血液里表面抗体能维持很长时间，直到老年期抗体水平才有所降低。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免疫作用。乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外，不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等。一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往HBV感染。 一般情况下，血清中抗HBs和HBsAg不同时存在，若同时检出，可能为抗HBs产生的早期，或属于不同亚型的HBV感染，或由HBV的S基因变异所致。,3HBeAg HBeAg一般通称e抗原，它来源于乙型肝炎病毒的核心。其在血清中的出现时间稍后于HBsAg，一般血清HBeAg阳性者，HBsAg亦为阳性。有研究表明，当乙肝病毒的前核心区发生点突变时，可使得HBeAg无法表达，表现为血清HBeAg或抗HBe测定持续为阴性，但血清HBsAg或HBV DNA可表现为阳性。,HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随关系，是HBV复制活跃的血清学指标，血清HBeAg阳性说明传染性强。急性乙肝病人血清HBeAg持续阳性3个月以上，则有疾病慢性化倾向。 有时临床实验室可见到HBsAg（）、抗HBs（+）、HBeAg（+）的模式，则很有可能在病毒编码HBsAg的基因区发生了突变。,4抗HBe e抗体是乙型肝炎e抗体的简称（抗-HBe），它是由e抗原刺激人体免疫系统产生出来的特异性抗体，当血清HBeAg转阴后，可出现抗HBe，两者同时阳性较少见。 但抗-HBe和抗-HBs不同，e抗体不是保护性抗体，不代表患者有了免疫力。有时虽然检查出e抗体阳性，但肝细胞内仍然可以查出乙型肝炎病毒DNA，表明病毒仍然存在。e抗体出现阳性是病毒复制降低并且传染减少的标志，这时病毒颗粒有可能已经很少，但并不表示病毒已被消除了。,5抗-HBc 核心抗体是乙型肝炎核心抗体的简称，可简写为抗-HBc。核心抗原虽然在血清中查不出来（它在血中很快被裂解），但是它具有抗原性，能刺激身体的免疫系统产生出特性抗体，即核心抗体，故检测抗-HBc可以了解人体是否有过核心抗原的刺激，也就是说是否有过乙肝病毒的感染。,抗HBc 可以说是机体感染HBV后在血液中最早出现的特异抗体，在乙型肝炎的急性期呈高滴度，是判断急性乙型肝炎的重要指标。随着急性乙肝的恢复，抗HBc IgM滴度降低乃至消失。如持续高滴度，则常表明病人乙肝有慢性化倾向。抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。,乙肝五项各项的临床意义,HBsAg阳性：血清HBsAg阳性，表示受检查处于HBV的感染状态，HBsAg也可从许多乙肝患者体液和分泌物中测出，如唾液、精液、乳汁、阴道分泌物等。 HBsAb阳性：多见于乙型肝炎处于恢复期，或既往曾感染过HBV，现在已恢复，而且对HBV有一定的免疫力；同时，HBsAb阳性是对接种乙肝疫苗后产生效果，即接种免疫成功的指标。,HBeAg阳性：见于HBV感染的早期，表示血液中含有较多的病毒颗粒，提示肝细胞有进行性损害和高度传染性；乙型肝炎加重之前，HBeAg即有升高，有助于预测肝炎病情，HBeAg持续阳性，易转为慢性乙型肝炎；HBeAg和HBsAg均为阳性的孕妇，可以将乙型肝炎病毒传播给新生儿，其感染的阳性率为70%-90%。,HBeAb阳性：多见于HBeAg转阴的患者，意味着HBV部分被清除或抑制，病毒复制减少，传染性降低；部分慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者可检出HBeAb；在HBsAg和HBsAb阴性时，如能检出HBeAb和HBcAb，也能确诊为乙型肝炎近期感染。 HBcAb阳性：是诊断急性乙型肝炎和判断病毒复制活跃的指标，并提示患者血液有效强传染性。同时，HBcAb阳性还见于慢性活动性乙型肝炎。,乙肝五项的32种组合,乙肝五项检测的影响因素,样本采集与处理的影响 1.1标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。,1.2塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。,1.3标本凝固不全 ，正常血液采集后1/22h开始凝固，1824h血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。,2、试剂的影响 2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异。,3、操作技术的影响 3.1加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。 3.2温浴影响，96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。,3.3冼涤是ELISA操作的重要环节，手冼条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。 3.4肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。,4、HooK效应影响 随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。,5、干扰物质的影响 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。 常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig 抗体、交叉反应物质和其它物质等。采用5630分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。,6、药物的影响 6.1、高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现。 如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的新生儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式。,6.2、为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。,乙型五项检测标准化操作,HBsAg 取出反应板条,设空白对照1孔（不加任何样品）、同时设阴性对照及阳性对照各2孔（分别加入阴性对照及阳性对照各75L）.其余空加入待测样品75L，37孵育60分钟。 然后每孔加入酶结合物1滴（50L）（空白对照孔不加）,充分混匀,用不干胶片封板,置37反应30分钟。 弃去各孔内液体,用洗液注满各孔,静置10秒钟（洗板机洗板静置60秒钟）,甩干,重复5次,拍干。 每孔加显色剂A.显色剂B各1滴（50L）,置37反应30分钟。 每孔加终止液1滴（50L）。,HBsAb、HBeAg、HBeAb 1.取出反应板条,设空白对照1孔（不加任何样品）、同时设阴性对照及阳性对照各2孔（分别加入阴性对照及阳性对照各50L）.其余空加入待测样品50L.然后每孔加入酶结合物1滴（50L）（空白对照孔不加）,充分混匀,用不干胶片封板,置37孵育30分钟。 2.弃去各孔内液体,用洗液注满各孔,静置10秒钟（洗板机洗板静置60秒钟）,甩干,重复5次,拍干。 3.每孔加显色剂A，显色剂B各1滴（50L）,置37反应15分钟。 4.每孔加终止液1滴（50L）。,HBcAb 1.取出反应板条,设空白对照1孔（不加任何样品）、同时设阴性对照及阳性对照各2孔（分别加入阴性对照及阳性对照各50L）。其余孔加生理盐水1：30稀释之待测样品50L（检测结果为临床意义）。然后每孔加入酶结合物1滴（50L）（空白对照孔不加）,充分混匀,用不干胶片封板,置37反应30分钟。 2.弃去各孔内液体,用洗液注满各孔,静置10秒钟（洗板60秒钟）,甩干,重复5次拍干。 3.每孔加显色剂A.显色剂B各1滴（50L）,置37反应15分钟。 4.每孔加终止液1滴（50L）。,假阴性的原因 在HBsAg的测定中，最大的问题是 （1）HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下。如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等。 （2） HBsAg基因的突变。 （3）HCV重叠感染对HBV复制或HBsAg的表达的抑制作用。 （4）测定方法所用抗体对HBV不同基因型检测敏感性的不同。 (5) “带现象”。,假阳性原因： 操作及仪器因素：加样、洗板、自动化加样系统的标本间“交叉污染”。 标本因素：RF、补体、异嗜性抗体、动物抗体、溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全。,注意事项 1.从冷藏环境中取出反应板条,应置室温平衡后方可使用。剩余板条应装入含干燥剂的塑料袋内封口。 2. 封片不能重复使用。 3.不同批号试剂不可混用，使用本试剂盒应视为有传染性。 4.于28避光保存，有效期一年。 5.由于试剂和技术操作上的原因，检测结果不能排除假阳性和假阴性的可能。同一份标本在不同实验室或采用不同的试剂盒可能会得出不一致的结果。因此，结果有争议时，应进一步采用中和试验确认或进行HBV-DNA测定。,梅毒螺旋体抗体检测,梅毒螺旋体抗体检测,目的：筛查有无梅毒感染 对妊娠的影响：可导致自发性流产、早产、围产儿死亡、患新生儿先天性梅毒等。,梅毒 梅毒是由梅毒螺旋体引起的慢性感染性疾病。梅毒螺旋体可以通过性接触和胎盘等方式传播。梅毒螺旋体不能够在体外培养，也不能用常规方法染色。实验室常用的检测方法包括典型溃疡处查找梅毒螺旋体和检测血清中抗体的存在。不同的感染阶段应选用不同的实验方法，溃疡并不是出现于疾病任何阶段，而抗体一般在溃疡形成后1-4周出现。,RPR-快速血清反应素环状卡片试验,原理 采用甲苯胺红不加热血清试验方法。试剂中的心磷脂作为抗原与抗体发生反应，卵磷脂可加强心磷脂的抗原性，胆固醇可增强抗体的敏感性。这些成分溶于无水乙醇中，在加入水后，胆固醇析出形成载体，心磷脂和卵磷脂在水中形成胶体状包裹在其周围，形成胶体微粒。将此抗原微粒混悬于甲苯胺红溶液中，加入待测血清，血清中的抗体与之反应后，可出现肉眼可见的凝集块。,操作 1.TRUST试剂和待测血清置室温.（18-25）平衡10min。 2.将待测血清（无需灭活处理）、阴性对照和阳性对照分别加至反应卡的样本圈内，每圈1滴（50uL）。 3.轻轻摇匀抗原试剂，垂直滴加1滴抗原于样本圈内。 4.旋转摇动卡片8分钟，立即肉眼观察结果。,结果判定 阴性：呈粉红色均匀分散颗粒。 阳性：出现粉红色凝集块，根据凝集块大小记录1+4+。 阳性反应若需定量检测，可将待测血清用生理盐水稀释后，按定性方法进行。,注意事项 1.试验需在室温中操作，结果稳定性、重复性好。