一测多评在中药制剂质量评价中的研究.doc

一测多评在中药制剂质量评价中的研究陈繁华1,邬伟魁1,严倩茹2,宋伟3（1.梅州市食品药品监督检验所,广东 梅州 514071；2.成都中医药大学药学院,成都 611137；3.湖北科技学院药学院,湖北 咸宁 437100）摘要：近年来我国中药质量评价新技术、新方法研究日益增多。该文总结了一测多评在中药制剂质量评价中的研究进展,对一测多评已应用的品种、测定的成分、内参物、样品数进行统计分析,指出了目前发表的研究论文在方法学等方面存在的不足,提出了一些改进建议；以期进一步规范一测多评的方法学考察、方法学验证等内容,提高一测多评在中药制剂质量评价中应用研究的质量。关键词：一测多评；中药；制剂；质量评价Study on multi-component determination of Preparation of TCM by QAMSChen Fan-hua1, Wu Wei-kui1, Yan Qian-ru2, Song Wei3（1.Mei zhou Institute for Food and Drug Control, Mei zhou 504071,China; 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China;3.Hubei Institute of Technology College of Pharmacy, Xianning 437100,China）Abstract：Based on the previous literatures, the overview on the recent advance of determination of Preparation of TCM by quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS) was summarized. The key questions of QAMS were also highlighted. It could be considered as a feasible method for the quality control of Traditional Chinese Medicines.Keywords：Quantitative analysis of multi-components by single-marker；TCM；Preparation；Determination多年来,中药制剂大多是以单一指标成分进行质量评价,难以真正体现中药多效性和整体性的特点。随着时代的进步,中药质量标准体系已进入了全新的快速发展阶段,一系列新技术(如LC-MS,指纹图谱等)、新方法(如DNA鉴定,多指标质量控制模式等)在国家标准中得到应用1。现代中药多成分同步质量控制模式出现了对照品供不应求,药品检验成本高昂等现实的问题,限制了多指标质量评价在科研、生产、监督检验中的应用。近年实践证明,一测多评(quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS)在中药质量评价中具有较强的适用性。QAMS的由来、原理、应用可行性、评价模式建立过程中涉及的关键问题及其在中药材中的应用已见综述报道2,此不赘述。本文主要介绍了QAMS在中药制剂质量评价中的研究进展,并就其存在的问题和发展前景进行讨论。1 QAMS的提出与发展简介中药质量控制是中药现代化的关键性技术问题,而中药多成分、多指标质量评价模式存在对照品紧缺等问题。如何通过一个易得成分的测定实现多个成分同时测定,是现代中药质控方法的现实化问题。2006年,王智民等3率先提出了QAMS的中药质量评价方法。QAMS的研究思路侧重从量上阐明主要成分或药效成分间的相互关系,可实现在对照品短缺的情况下,对多指标成分进行含量测定。这种符合中药特点的多指标质量评价新模式逐渐被业内接受并认可,许多研究者进行了深入的研究4-6,并在部分中药材、饮片、配方颗粒、复方制剂中得到应用研究,甚至还用于中药材提取工艺的优选7。2008年,QAMS被应用于中药复方制剂的含量测定；2010年,QAMS同时测定黄连中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱等5 个成分含量的方法被中国药典收录8；2011年,制订了一测多评法建立的技术指南9(下文简称指南)。目前,有些企业已实现了这一技术在中成药的应用,提高了检测效率和药品质量控制标准,相关技术有望申请国家专利。第十届药典委员会在中国药典2015年版编制大纲中明确指出,要完善中药质量控制模式,建立完善有效活性成分测定、多成分同步定量以及特征或指纹图谱检测技术；要加强有效性的质量控制,积极采用现代科研成果，加大科研成果向标准转化的力度，增加和完善专属的与疗效相关的鉴别、检查、含量测定项目,重点引入一测多评、指纹和特征图谱、DNA分子鉴定、生物测定等新的分析方法和检测技术。相信在2015年版中国药典中将有更多的中药材和成方制剂采用此方法进行含量测定。2 QAMS在中药制剂中的研究概况以“一测多评”、“QAMS”作为检索词检索CNKI数据库,并对结果进行逐一筛查发现,至2013年2月该库收录21篇QAMS在中药制剂中的应用研究。一测多评已经在双青咽喉片(A)、丹参注射液(B)、银黄片(C)、咳喘宁片(D)、牛黄解毒片(E)、消炎利胆片(F)三黄片(G,G1,G2)、复方丹参片(H)、银黄制剂(I, 银黄颗粒I1, 银黄胶囊I2, 银黄含片I3, 银黄片I4)、双黄连制剂(J,双黄连口服液J1,双黄连胶囊J2,双黄连片J3,双黄连口含片J4)、香连制剂(K,香连丸K1,香连片K2,香连胶囊K3)、热痹消颗粒(L)、穿心莲片(M)、新清宁片(N)、元胡止痛胶囊(O)、冠脉康胶囊(P)、麦贞花颗粒(Q)、银杏叶胶囊(R)、速效救心丸(S)、湿疹软膏(T)等 20 多种中药制剂(注：以字母编号)的多成分定量测定和多指标质量控制中得到了探索研究(见表1)。表1 已开展一测多评研究的中药制剂品种和化学成分类别制剂生产厂家数量样品批次数量药物组成组成数测定成分类别测定成分数文献A13金银花提取物、青蒿油、青果提取物、乌梅提取物、甘草酸单铵、薄荷脑6苯丙素等1010B518丹参1酚酸711C713金银花提取物、黄芩提取物2有机酸612D620桔梗、石膏、罂粟壳、甘草、麻黄、百部、苦杏仁7生物碱513E33牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草8蒽醌514F130穿心莲、溪黄草、苦木3内酯415G1022大黄、盐酸小檗碱、黄芩浸膏3黄酮416922蒽醌417H120丹参、三七、冰片3丹参酮418I1828金银花提取物、黄芩提取物2黄酮419I1915I277I315I411J1237金银花、黄芩、连翘3黄酮420J1624J239J323J411K1616黄连、木香2生物碱421K199K233K344L110黄柏、萆薢等8生物碱422M1010穿心莲1内酯423N120熟大黄1蒽醌424O38延胡索、白芷2香豆素等325P33葛根、丹参等2黄酮等326Q110麦冬、女贞子、红花、槐米4黄酮等327R412银杏叶提取物1黄酮328S13川芎、冰片2萜类329T110白芷、大黄等2香豆素230表2 已开展一测多评研究的中药制剂中化合物之间的校正因子制剂测定成分参比物色谱柱流动相校正因子文献A没食子酸、柠檬酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、甘草酸单铵、蒿酮没食子酸AkzoNobel Kromasil C18, Lubex Kromasil C18, Phenomenex Luna C18, Dikma Platisil ODS乙腈-0.1%磷酸水0.015,0.418,0.420,0.418,O.517,0.518,0.516,0.096,0.64110B原儿茶酸、丹参素钠、原儿茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B原儿茶醛Waters Symmetry C18, Inertsil ODS SP, CAPCELL PAK C18乙腈-0.05%三氟乙酸水8.96,2.57,2. 63,1.17,2.27,4.9911C绿原酸(5-O-咖啡酰奎宁酸)、3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、4, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-O-二咖啡酰奎宁酸、 3, 4-O-二咖啡酰奎宁酸绿原酸钻石二代, 资生堂 G120,Thermo, kromasil, Agilent-extend,Phenomenex Luna, 大连依利特(BDS)乙腈-0.4%磷酸水1.0112,1.0198,1.0534,1.1886,1.224112D吗啡、磷酸可待因、盐酸罂粟碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱吗啡Agilent XDB-C18,Agilent ZorbaxSB-C18,Alltima C18,Shim-pack VP-ODS C18,Shim-pack VP-ODS,Shiseido C18 MG2乙腈-0.1%磷酸水1.357,0.542,2.410,2.46513E大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚大黄素Diamonsil C18甲醇-0.1%磷酸水1.351, 1.010, 1.490, 0.57114F穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯穿心莲内酯Phenomenex C18, Agela C18, Agilent C18, Dionex C18乙腈-水1.156,0.769,0.75915G1黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素黄芩苷Xtimate TM C18甲醇-0.2% 磷酸水1.22,1.61,1.6316G2大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚大黄素Diamonsil C18,Synergi Hydro-RP C18,Kromasil C18,Xtimate C18,Accurasil C18甲醇-0.4% 磷酸水1.13,1.46,1.0117H丹参酮A/二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮丹参酮AEcosil C18,Merck Purospher STAR RP-18e,Agilent TC-C18,Inertsil ODS-3,Waters Symmetry C18, Waters SunFire C18甲醇-水1.614,0.737,2.28318I黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素黄芩苷Diamonsil C18,Gemini NX C18,Kromasil C18,Xtimate TM C18、Accurasil C18甲醇-0.2% 磷酸水1.20,1.62,1.6819J黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素黄芩苷Xtimate TM C18甲醇-0.2% 磷酸水1.22,1.69,1.6520K小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀小檗碱Kromasil 100-5 C18乙腈-水(45：55,含50mmolL-1磷酸二氢钾,25mmolL-1十二烷基磺酸钠,pH3)0.980,0.911,1.00821L小檗碱、黄柏碱、药根碱、巴马汀小檗碱Kromasil C18,Welch Materials C18,Hedera C18乙腈-0.1%磷酸水(3664,每 1 000 mL中加入2 g 十二烷基磺酸钠)3.025,0.966,0.96522M脱水穿心莲内酯、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯脱穿心莲内酯依利特 Hypersil C18,Dikma Diamonsil C18,SHISEIDO C18,GL Inertsil C18乙腈-水0.9685,0.6356,0.864223N大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚大黄素Accurasil C18甲醇-0.4% 磷酸水1.107,1.438,1.01624O欧前胡素、异欧前胡素、延胡索乙素欧前胡素Dikma Diamonsil C18, Phenomenex Gemini C18, Phenomenex Luna C18, Boston Analytics甲醇-0.1% 磷酸水0.8597, 0.627225P葛根素、丹酚酸B、大豆苷元葛根素Ultimate C18, Hypersil ODS, Diamonsil C18, Hypersil C18, Thermo ODS-2 Hypersil,Eclipse XDB C18,CenturySIL C18 EPS,Kromasil C18005%甲酸水-005%甲酸甲醇0.228,8.4526Q芦丁、特女贞苷、羟基红花黄色素A芦丁Hedera C18,Sunfire C18,Phenomenex C18,Hypersil C18甲醇-0.2% 磷酸水1.349,0.89127R槲皮素、山柰素、异鼠李素槲皮素Agilent TC-C18,大连依利特 Hypersil BDS C18、Phenomenex Luna C18甲醇-0.4% 磷酸水0.9754,0.935828S右旋龙脑、异龙脑、左旋龙脑右旋龙脑CYCLOSIL-B弹性石英手性毛细管柱载气为氮气0.9651,1.014829T欧前胡素、异欧前胡素欧前胡素Suplco C18,Thermo ODS-2 HYPERSIL,Agilent HC-C18甲醇-水0.99630注：校正因子栏数据为测定成分相对于参比物的校正因子。 2.1 QAMS已应用于多种剂型研究QAMS在中药制剂质量评价中的研究涉及多种剂型,包括片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、注射剂和外用软膏等,其中以片剂和胶囊剂为主。所用制剂多为市售中成药,部分为医院制剂(热痹消颗粒)和自制制剂(双青咽喉片、湿疹软膏)。药物组成从1味(如新清宁片和穿心莲片)到8味(如热痹消颗粒和牛黄解毒片)不等,1至3味的制剂占多数。值得注意的是,虽然是对复方制剂进行质量控制,但QAMS测定的成分主要还是制剂中某味药的某类相似物。QAMS已在20多种中药材中得到研究,但与中药材质量评价不同的是,制剂是一个更复杂的体系,其他成分和辅料等物质会干扰指标成分的分析。2.2 QAMS测定成分及内参物分析中药有效成分多为类群物质,类群间存在某些内在关系。已报道QAMS测定的成分涉及多种化合物类型,包括黄酮类、蒽醌类、生物碱、有机酸、内酯类等,所选成分是制剂中药理作用比较明确的有效成分或与临床功效具有相关性的指标性成分。所选内参物的对照品是相对易得者,如绿原酸、黄芩苷、大黄素等,符合指南要求。同步测定成分从2个到10个不等。何兵等10在HPLC 法一测多评同时测定双青咽喉片中 10 种成分的基础上,建立一测多评法的方法学考察模式,并成功验证了此方法在双青咽喉片中应用的可行性和技术适应性。2.3 样品数统计分析指南【3.2样品收集】项下规定,选择有代表性药材作为研究样本,样本数应满足统计学的相关要求,原则上拟建立质量标准的药材样品不低于40批。药材应包括主产地、道地产区、GAP 基地的药材和饮片样本。该项目未对中药制剂样品收集来源及批次进行规定,有待进一步深入研究,加以完善。据统计,上述中药制剂QAMS研究中,样品数都低于40批,牛黄解毒片等样品数甚至只有3批。中药制剂成分复杂,指标成分含量测定受处方、工艺、添加剂等多种因素影响,综合分析,样品数不应太少,建议指南【3.2样品收集】项下增加“选择有代表性中药制剂作为研究样本,样本数应满足统计学的相关要求,原则上拟建立质量标准的中药制剂样品不低于40批,应尽量涵盖不同生产企业的样本。”2.4 方法学考察的不足指南要求：HPLC色谱仪、常用色谱柱、实验室、操作人均应3。但是,上述中药制剂QAMS研究中,很多都没有达到此要求(图2)。可见,目前发表的研究在方法学考察等方面存在的缺陷,建议以后的研究参考指南要求,进行规范的方法学考察、验证,进一步提高一测多评在中药制剂质量评价中应用的质量。3 中药制剂QAMS研究与其他新技术新方法的关系中药制剂生产工艺多样、成分复杂,单一成分很难全面评价其质量。QAMS是现代化和现实化相结合的中药质量控制新技术与新方法,解决了制约中药标准制定过程的重要关键技术问题。但是,中药制剂QAMS不是一种孤立的方法,它与其他“化繁为简”系列新技术新方法的关系密切。有研究者采用相同的思路开展相似的研究,如替代对照品法、内标多控法、内标校正法、系统内标法等,取得了良好的效果。(一)关于QAMS与“对照提取物”。中药标准物质主要有中药化学对照品、对照药材、对照提取物3大类。指南指出,对于成分复杂的样品,通过相对保留值或保留时间差等参数不能准确定位时,可选用定性用的对照品或“对照提取物”。研究制备含量测定用的复方对照提取物,可以同时标示多个成分含量,达到一侧多评的目的。有研究者31制备了六味地黄丸对照提取液,对六味地黄丸提取物中 5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚的量进行标定。(二)关于QAMS与“区间指纹图谱”。目前指纹图谱已成为公认的控制中药质量的有效手段。近年来对中药指纹图谱进行了很多探索性研究,但是瓶颈很多,如中药成分的复杂性,指纹图谱的分析结果中往往有大量的杂质峰群存在,而现有的分析手段很难使这些杂质峰群达到很好的分离,为此有研究者32提出了构建“区间指纹图谱”,并以神安颗粒为例进行了分析。“区间指纹图谱”与QAMS的思路都是“化繁为简,避难就易”。但是,二者之间的实质联系还没有更具深度的报道。今后如果能将二者结合起来研究, 或将对中药质量控制和评价模式的发展起到更大作用。4 QAMS与现代药品监督检验中药制剂在继承和改进传统剂型的基础上,采用现代制剂技术和工艺创制了一些新剂型、新品种,从而丰富了临床用药。近年来,中成药(特别是中药注射剂)的质量和安全问题凸显,国家对药品的监管力度逐年加大,药品检验成本企高,药品质量是生产出来的,不是检验出来的“质量源于设计”(Quality by Design,QbD)理念渐成制药界共识。美国FDA 已落实“质量源于设计”理念多年,并借此拓展出更灵活的管理办法33：可根据风险协助做出药政管理决定,通过“实时”控制,减少产品的放行检验,一旦可确认设计空间,则在此设计空间中的各种工艺等方面的变化,无需进行进一步的注册审批,减少上市后的申报。值得注意的是,虽然目前我国中成药的生产已实施严格的GMP制度,但实质仍处在“检验控制质量”阶段,其不足之处主要体现在每批药品的数量较大,抽检样品的质量不能完全反映整批药品的质量；检验是一种事后行为,药品检验的合格率与药品安全事件发生率关联性不强。建议进一步加强中药产品质量过程控制,深入开展以QAMS为代表的符合中药特点的制剂质量评价研究,制订完善相关技术指南,规范方法学考察、方法学验证等内容。药品监督检验的控制点需前移,从过去单纯依赖终产品检验,到对生产过程的控制,再到产品的设计和研究阶段的控制。树立药品监管新理念,从源头上强化注册监管,确保药品质量和安全。5 结语现行药品标准中,80%以上的中成药采用单一指标控制药品质量。市售中成药除了含有标准控制的指标成分外,同时还含有其他有效成分,作者在日常药品检验中发现,中药制剂的含量比例参差不齐,部分厂家的制剂中,指标成分的含量远远高于其他成分,但是同药材中各成分的含量比例不符。因此,药典中仅以单一指标成分作为质量评价的指标难以监控其非法添加,无法保证药品的质量和安全。QAMS同步测定多成分的含量,可更全面地快速监控药品质量。现代中药制剂质量标准与评价体系亟待不断规范化、标准化,使其在反映中药特点的同时,更完善、合理、科学。自2008年第1篇复方制剂QAMS研究论文发表以来,QAMS在中药制剂质量评价中的研究取得了可喜的进展,且该方法被不断完善创新,如“一测多评中待测成分校正和定位的新方法研究”34、“不同色谱条件对QAMS相对校正因子及相对保留值影响的实验研究”35。但还可以从以下几方面进一步深入研究。加强QAMS测定药材多成分含量的研究与应用；一侧多评法已应用的药材（如黄连）应加强QAMS测定相关制剂中多成分含量的研究应用；尤其是对于某些对照品不稳定、获得困难的品种,应优先研究；研究的数量迅速增长,但质量参差不齐,在研究样本数和方法学等方面仍需进一步规范完善；部分论文存在的另一个问题是报告不规范,导致无法判断是研究本身质量不高还是报告书写的问题,需规范论文撰写。参考文献1王智民,钱忠直,王永炎.中药产品质量过程控制J.中国中药杂志,2011,36(6):656-656.2高慧敏,宋宗华,王智民,等.适合中药特点的质量评价模式QAMS研究概述J.中国中药杂志,2012,37(4):405-416.3王智民,高慧敏,付雪涛,等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究J.中国中药杂志, 2006, 31(23): 1925-1928.4刘晖晖,张辉,莫结丽,等.一测多评法测定黄连配方颗粒中4个成分的含量J.中国药业,2012,21(10):39-40.5张红伟,张振凌.“一测多评”法在中药质量控制中的研究进展J.海峡药学,2010,22(11)：88.6陆兔林,石上梅,蔡宝昌,等.基于一测多评的中药多成分定量研究进展J.中草药,2012,43(12):2525-2529.7汪坤,张振凌,贾秀梅.一测多评法优选黄连最佳提取工艺J.中国实验方剂学杂志,2011,17(24):9-11.8国家药典委员会.中国药典M.一部.北京:中国医药科技出版社, 2010, 285.9王智民,钱忠直,张启伟,等.一测多评法建立的技术指南J. 中国中药杂志, 2011, 36(6): 657.10何 兵,刘 艳,杨世艳,等.HPLC一测多评法同时测定双青咽喉片中10 种成分J.中草药,2013,44:DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.08.00011李安平,杨锡,丁永辉,等.一测多评HPLC法测定丹参注射液中7个水溶性成分含量J.药物分析杂志,2012,32(9):1534-1540.12林永强,徐丽华,王淑华,等.一测多评法同步测定银黄片中6种咖啡酰奎宁酸J.中草药,2012,43(4):706-710.13刘永利,李冬梅, 冯丽,等.“一测多评”法测定咳喘宁片中5种生物碱类成分的含量J.中药新药与临床药理,2012,23(4):464-468.14陶君,张瑞红,王国振,等.牛黄解毒片中一测多评技术的应用探讨J.河北中医药学报,2012,27(3):38-40.15林 青,匡艳辉,黄 琳,等.一测多评法测定穿心莲及其制剂中内酯类成分J.中草药,2012,43(12):2406-2411.16吉丽娜,冯伟红,王智民,等.“一测多评”法与外标法测定三黄片中4种黄芩黄酮类成分J.中成药,2012,34(11):2128-2133.17王钰莹,冯伟红,杨菲,等.“一测多评”法测定三黄片中的大黄蒽醌类成分J.中国中药杂志,2012,37(2):212-217.18吴笛,臧忠良,王德勤,等.一测多评法测定复方丹参片中4种丹参酮类成分的含量J.中国药学杂志,2012,47(18):1509-1513.19杨菲,冯伟红,王智民,等.一测多评法测定银黄制剂中