覃重军(多拉菌素).ppt

中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 合成生物学重点实验室,覃重军,利用基因组工程技术改良多拉菌素工业菌株,第一代：阿维菌素 第二代：由阿维菌素衍生的依维菌素 第三代：多拉菌素（doramectin）是辉瑞公司在1995年利用 基因工程的方法阻断起始单元的合成，在突变株中补加 环己烷甲酸，在阿维菌素c25位上连接环己烷基,即25-环 己烷基阿维菌素b1a。多拉菌素被认为是新型阿维菌素 族中最好的驱虫药。,主要的生物兽药阿维菌素类抗生素,（2002年世界兽药产值113亿美元，我国180亿人民币）,存在的问题,由于市场前景良好，国内企业仍无法购买多拉菌素菌株。 由于是基因工程构建的菌株，国内企业一般无法模仿。,利用基因组工程技术改良除虫链霉菌,2004年开始与浙江 海正药业集团公司 （年产值30亿）合作,沈美娟（高级实验师） 夏海洋（博士生） 党福军（研究助理） 徐晴雨（研究助理） 路志群（博士生） 陈威华（博士生） 张亮（硕士生） 胡敏杰（硕士生）,海正药业参与本项目的主要人员,王海彬（生物技术中心副主任） 黄隽（微生物菌种室副主任）,与海正药业集团公司的密切合作,多拉菌素项目获得的资助,1、中国科学院知识创新工程方向性项目（先进工业生物技术创新基地）：利用基因组工程改良多拉菌素工业生产菌株，2006.10-2009.10，180万元。 2、科技部863重点项目子课题：瑞拉菌素和多拉菌素等产品的规模化生产关键技术，2007.12-2010.12，130万元。,多拉菌素项目的主要创新点,在除虫链霉菌基因组操作技术方面： 构建了有序排列的基因组文库 建立了大片段dna的敲除技术 建立了大片段dna的体内克隆技术 建立了以质粒为标记的基因组改组技术 在除虫链霉菌基因工程技术方面： 克隆了个链霉菌抗生素生物合成的正调控基因 利用合成生物学技术全合成了含有11个位点突变的avec基因,、在操作工业生产菌种和发酵生产方面： 利用质粒为标记的基因组改组技术提高了基因工程菌gdf3-26 的产素能力 已经完成5吨、30吨大罐发酵，2009年7月 的发酵单位约1200mg/l，达到了大规模 工业生产的水平,多拉菌素项目的产业化,1、中科院与海正药业与2009年联合申请了国家发改委的“年产20吨多拉菌素高技术产业化”的项目，已获批准。 2、浙江海正药业集团公司将于2010年开始生产多拉菌素，预计年销售收入6亿元，利税总额1.8亿元。,多拉菌素的规模化生产,多拉菌素项目的意义,本项目的成功实施，是我国利用基因组工程构建和改良抗生素工业生产工程菌株的第一例，对于利用基因操作技术提升我国抗生素大型企业的竞争力具有重要意义。,利用基因组改造技术大幅度 提高尼莫克丁工业菌株的效价,基因工程菌株发酵效价达1730 mg/l， 与出发菌株900 mg/l相比， 产素水平提高近1倍。,寡霉素高产和单组份的菌株,基因组工程技术的推广,与海正药业集团公司新一轮的合作：,对多拉菌素、多杀菌素、泰乐菌素、尼莫克丁、卑霉素、奥丽斯它、埃博霉素等重要的药物工业生产菌株进行遗传改良,新技术,1.粘细菌、高温链霉菌等的遗传操作系统 2.体内“加减法”克隆大片段dna技术 3.天蓝色链霉菌的基因组工程,建立若干新型的载体宿主系统， 包括嗜盐拟诺卡氏菌、红球菌、 小单孢菌、糖多孢菌、南极适冷菌等。 发展新的基因组操作技术。,连续敲除染色体上的pks/nrps基因簇,已经连续敲除全部9个pks/nrps基因簇，并完成去除标记,50c 45c 37c 30c,thermophilic streptomyces sp. 4f,s. coelicolor m145,s. venezuelae isp5230,s. glaucescens gla 4-26,20 h,30 h,40 h,60 h,37c 30c,37c 30c,37c 30c,2102,2103,2104,2105,2102,2103,2104,2105,5101,5102,5103,5104,5101,5102,5103,5104,快速生长、耐高温的链霉菌,线型质粒的优势：容纳1000kb,8700 kb,350 kb,400 kb,700 kb,dna大片段在线型质粒上扩增,发现1400 kb的巨大线型质粒,课题组主要研究工作：,基础研究,新技术,产业化,当前微生物学发展的大趋势： 应用微生物（医、药、工业、农业等）的基础研究、 不断为生命科学提供新的工具、满足经济和社会发展的需求,基因工程改良多拉菌素高技术产业化,浙江海正药用植物有限公司 2009-12-06,立项背景,兽药企业年产值保持在150-200亿元左右 1976年，阿维菌素类抗寄生虫被首次发现，并且迅速在世界范围内被大规模推广使用。但是这些药物药效差、稳定性低、药物残留多等缺点，给农牧业造成严重损失，每年损失达10亿元。 多拉菌素因为其抗寄生虫强、疗效好、残留低，成为目前全球最好的抗寄生虫药之一。但是目前全球只有辉瑞独家生产，中国均从辉瑞进口，价格昂贵。,多拉菌素,1%多拉菌素注射液50ml 市场售价可高达120-200元 全世界市场容量当能达到20亿美元以上,项目基础-注册方面,2006年6月13日 多拉菌素原料药新兽药注册证书 （2006）新兽药证字23号 多拉菌素注射液新兽药注册证书 （2006）新兽药证字24号 2008年7月3日 国家兽药产品批准文号批件兽药字（2008）110272290 新兽药注册证书 （2006）新兽药证字23号110272293、110272294,项目建设方案 （2007年6月2009年12月）,符合中国兽药典标准 通过美国fda认证 一条国际标准的生产线 取得欧盟cos证书 以欧美cgmp标准的药品生产厂房 符合国际标准的全自动控制发酵系统 以qehs为基础的全流程提取系统,按无水物计算， 含多拉菌素不得少于95.0%,建设内容,建筑面积15480平方米。 建设发酵车间一幢、提取车间一幢、仓库一幢。 发酵车间： 发酵罐80m3的12个、70m3的6个，发酵总体积为1380立方米。 提取车间： 多功能萃取罐：15 m3的4个，总体积60 m3； 分离纯化：4 m3交换柱10个； 浓缩结晶：2 m3浓缩结晶罐6个； 结晶过滤：10m2芬达过滤器2个； 液固分离：400m2板框3个； 其他： 溶剂储存：30 m3溶剂储罐6个； 溶剂回收：1800*17000的溶剂回收塔1个； 中水回用：320 m2的反渗透膜1个。,技术经济指标,1）发酵单位：1200r/ml； 2）发酵周期1415天； 3）提取收率：70%； 4）年产量：20吨； 5）生产成本：1200015000元/kg,产品80%以上出口欧美发达国家主流市场,资金筹措,本项目总投资15227.37万元 申报国家补助2280万元； 申请地方部门配套800万元； 企业自有资金12147万元，已投入约70%的建