第7章_第4节_分子杂交和印迹技术(3_LMJ).ppt

基因操作,第七章,gene manipulating,2019年4月6日1时48分,1,2019年4月6日1时48分,2,第四节,分子印迹与杂交技术,molecular blotting & hybridization technology,江黎明 2013年10月,指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization),印迹(blotting),指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。,2019年4月6日1时48分,3,marmum和doty1961年发现的dna变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。,(heteroduplex),2019年4月6日1时48分,4,一、印迹技术(blotting),1975年edwen southern建立的dna印迹杂交。,指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。,转移缓冲液,纸巾,玻璃板,（1）印迹：,电转移,真空负压吸引转移,whatman滤纸,凝胶,whatman滤纸,重物,nc膜或尼龙膜,毛细作用转移,2019年4月6日1时48分,5,nc膜上载有的dna单链分子就可以在杂交液中与另一种dna或rna分子(称为探针，可用同位素或非同位素标记)进行杂交。,具有互补序列的rna或dna标记探针结合到存在于nc膜的dna分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。,（2）杂交：,（3）显示：,2019年4月6日1时48分,6,（1）特定基因序列的定性和定量分析,核酸分子杂交应用,（2）基因克隆的筛选,（3）酶切图谱的制作,（4）基因突变分析,（5）疾病的诊断,2019年4月6日1时48分,7,二、探针的种类和制备,探针(probe)的概念：,用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的dna或rna的互补标记片段：,与待测特定核苷酸的某一段序列相互补；,有明确的标志用于后续的检测。,2019年4月6日1时48分,8,探针的种类,寡核苷酸探针,基因组dna探针,cdna探针,rna探针,（一）常用探针的种类,dna探针,2019年4月6日1时48分,9,1dna探针,双链探针:,单链探针,从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；优点则是容易制备。,用化学法合成或从克隆在m13噬菌体的特异性基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补链的干扰。,2019年4月6日1时48分,10,2rna探针,早期采用细胞mrna和病毒rna作探针,主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选hiv的基因组dna克隆、进行中的转录分析等式。,与dna单链探针相比，rna探针具有标记效率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点,标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率往往不高，且受多种因素的制约。,2019年4月6日1时48分,11,（二）核酸探针的标记,根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。,理想标记物 应备条件,不影响碱基对特异性,有较高的化学稳定性,检测方法高度特异、灵敏,标记及检测方法简单,环保，无损害,价格低廉,2019年4月6日1时48分,12,优点,缺点,灵敏度和特异性极高,半衰期短, 随用随标,1.放射性同位素标记探针,对各种酶促反应无任何影响,不影响碱基配对的特异性与稳定性,放射性污染,用于核酸探针标记的放射性同位素主要有32p、3h和35s等；32p应用最多。,2019年4月6日1时48分,13,32p的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。,缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放射自显影后x胶片上的信号有时边缘不清。,r-32p atp,a-32p datp,*,*,3,h,2,datp,2019年4月6日1时48分,14,当双链dna一条链上产生切口时，e.coli dna聚合酶的53聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3羟基末端；同时，53的外切酶活性能从切口的5端除去核苷酸。,最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。,(1) dna切口平移(nick translation) 标记法,在切去切口5端核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，可使切口沿着dna链移动；用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。,2019年4月6日1时48分,15,核酸探针的标记方法,dna酶：在双链dna上随机打开若干个单链缺口，产生3-oh端。,大肠杆菌dna聚合酶：53 dna聚合酶活性； 53 外切核酸酶活性。,dna切口平移标记法示意图,2019年4月6日1时48分,16,使寡核苷酸随机引物与dna模板结合，在klenow酶的作用下，合成dna探针。,合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dntp和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。,(2) dna随机引物标记法,2019年4月6日1时48分,17,随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096,dna聚合酶klenow片段：保留53 dna聚合酶活性,弱35外切酶活性，无53外切酶活性。,dna随机引物标记法示意图,2019年4月6日1时48分,18,优点：,klenow片段没有53外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针；,对模板的要求不严格，用微量制备的质粒dna模板也可进行反应；,产物的比活性较高，可达4109 cpm/g探针；,随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中直接进行。,2019年4月6日1时48分,19,完整双链dna,-32p-dntp,其他3 种dntp,5 末端突出的dna,3 末端标记的dna,32p-末端标记的单链dna探针,1) dna的3末端标记,(3) dna的末端标记,2019年4月6日1时48分,20,条件是有5-oh存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链dna需用碱性磷酸酶切除5-p后再标记,5pcpgptpa3,5ho-cpgptpa3,t4噬菌体多核苷酸激酶,-32p-atp,532p-o-cpgptpa3,37，反应10min, -32p-atp 需150 ci/反应,2) dna的5末端标记,碱性磷酸酶,2019年4月6日1时48分,21,标记探针的纯化,凝胶过滤层析,常用的凝胶基质：sephadex g-50、bio-gel p-60,选择性沉淀,乙醇存在，醋酸铵可起此作用。,2019年4月6日1时48分,22,核酸探针的标记方法,(1) dna切口平移标记法,(2) dna随机引物标记法,(7) rna探针的标记,(3) dna的末端标记,(4) cdna探针的标记,(5) 寡核苷酸探针的标记,(6) 单链dna探针的标记,2019年4月6日1时48分,23,2. 非放射性标记物,优点,缺点,灵敏度较放射性同位素标记低,无放射性污染,用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛和荧光素(fitc、罗丹明)等。,稳定性好,可较长时间存放,特异性较放射性同位素标记低,2019年4月6日1时48分,24,2019年4月6日1时48分,25,the method used to produce nonradioactive dna molecules that carry a specific chemical marker that can be detected with an appropriate antibody.,biotin-avidin system,dig-dutp,hrp/ap标记抗体与dig结合,漂洗和封闭,底物与抗体-hrp /ap反应, 显色或发光,底物, 电泳,转膜，紫外交联固定,north-south 杂交原理和操作流程(地高辛标记),杂交：dig标记的探针与靶dna结合,2019年4月6日1时48分,26,别名：vitamin h 分子量：244.31 水溶性好,关于生物素,结合对象：,亲和素avidin 链亲和素streptavidin 中性亲和素neutravidin 单体亲和素mono avidin,2019年4月6日1时48分,27,north-south 杂交原理和操作流程(biotin标记),杂交：生物素标记的探针与靶dna结合,底物在hrp催化下,反应发光,洗膜封闭,电泳,转膜，紫外交联固定,hrp标记的链亲和素与探针上的生物素结合,2019年4月6日1时48分,28,1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上x光片，曝光1-5 分钟；,2.显影：取出x光片，按使用说明书显影和定影。,后继的化学发光检测,luminol化学发光原理,2019年4月6日1时48分,29,思考题：,三、印迹技术的种类和用途,（一）dna印迹杂交技术,（二）rna印迹杂交技术,（四）蛋白质印迹杂交技术,（三）其它核酸印迹杂交技术,2019年4月6日1时48分,30,（一）southern印迹杂交,southern印迹杂交（southern blotting）是指dna与dna分子之间的杂交。,基本过程:,将琼脂糖凝胶电泳分离的待测dna片段变性，再将凝胶中的dna分子转移到硝基纤维膜等固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的dna。,可用于基因组dna的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。,2019年4月6日1时48分,31,southern印迹杂交的基本步骤:, 待测dna样品的限制性内切酶消化, 酶切dna样品的电泳分离, 凝胶中dna的变性和southern转移, 探针的制备, southern杂交, 杂交结果的检测,2019年4月6日1时48分,32,2019年4月6日1时48分,33,（二）northern印迹杂交,利用类似于southern印迹杂交的技术来检测rna称为northern印迹杂交（northern blotting）。,原理和过程与southern印迹基本相同，只是检测的分子是rna，可用来对组织或细胞中的mrna进行定性或定量分析。,2019年4月6日1时48分,34,northern 与southern blotting的异同点,2019年4月6日1时48分,35,将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜)，这种膜只吸附单链dna；,用naoh处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使dna变性吸附在膜上；,用无关的单链dna，如小牛胸腺dna和鲑鱼精子dna预杂交。,膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。,3.膜上分子杂交*,方法：,2019年4月6日1时48分,36,（三）其他核酸杂交方法,（1）菌落杂交法 colony hybridization method,对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(200) 进行克隆筛选时，可采用本方法。,将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。,主平板应贮存于4直至得到筛选结果。,2019年4月6日1时48分,37,2019年4月6日1时48分,38,screening a genomic library by colony hybridization.,（2）噬菌斑杂交法 plaque bybridization,噬菌体为载体进行dna克隆繁殖时所常用的方法。,将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于 硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体dna变性；,dna固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位 素标记的特定的rna或dna片段进行杂交；,通过放射自显影法来识别含有所需dna序列的噬 菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与 其对应的噬菌斑,2019年4月6日1时48分,39,embl3/4系列(置换型，适用于基因组dna文库构建),4/6/2019 1:48 pm,40,2019年4月6日1时48分,41,（四）蛋白质印迹技术(western blotting),根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（nc膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。因此，被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。,用western blotting检测样品中存在特异蛋白质 用于细胞中特异蛋白质的定量分析 用于蛋白质分子的相互作用研究,2019年4月6日1时48分,42,(1)蛋白样品的制备,western blot 流程,(2) sds-page,(3)转膜,(4)封闭,(5)抗体杂交及 底物显色,（1）蛋白样品的制备,总蛋白制备,水溶液提取法：大多数蛋白质在稀盐和缓冲液中稳定性好、溶解度大；故稀盐和缓冲液是提取蛋白质最常用的溶剂。,有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇和丙酮。,通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。,2019年4月6日1时48分,44,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量：,bradford法（考马斯亮蓝法） lowry法（folin-酚试剂法） bca法（二喹啉甲酸）等。,各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应说明操作，测定样品浓度。,蛋白样品的变性,100mm tris-hcl(ph6.8) 200mm dtt 4%sds 20%甘油 0.2%溴酚兰 ddh2o,2sds-page上样缓冲液：,按1:1与蛋白质样品混合，95-100加热5-15min，冰上冷却后，上样20-25l，总蛋白量20-50g。,2019年4月6日1时48分,46,（2）sds聚丙烯酰胺凝胶电泳,2019年4月6日1时48分,47,湿转系统,（3）转膜,2019年4月6日1时48分,48,半干转移系统,2019年4月6日1时48分,49,常用的蛋白质转移膜,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。,转膜后检测（此步可以省略）,印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记a蛋白探针的western印迹过程。,2019年4月6日1时48分,51,为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或bsa（室温孵育1h） western blot 膜封闭液（生物试剂公司） tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,（4）封闭,2019年4月6日1时48分,52,hrp/ap标记抗体与蛋白结合,漂洗和封闭,底物与抗体-