氟苯尼考残留检测ELISA试剂盒说明书.doc

中山市粤尔生物技术有限公司 YE-11-01氟苯尼考（Florfenicol）ELISA检测试剂盒说明书一、 原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氟苯尼考和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氟苯尼考抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物氟苯尼考的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物氟苯尼考的含量。二、 试剂盒技术指标交叉反应率氟苯尼考100%氟苯尼考胺4.1%甲砜霉素 1%氯霉素 0.1% 三、 试剂盒组成1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb3、 酶标记物 12ml4、 抗体浓缩液 7ml5、 底物 A液 7ml6、 底物 B液 7ml7、 终 止 液 7ml8、 20X浓缩洗涤液 40ml9、 2X浓缩复溶液 50ml四、 所用仪器、试剂具备的仪器：微孔板酶标仪、氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）微量移液器：单道 20l-200l、100l-1000l、多道 250l试 剂：乙酸乙酯、正己烷。五、 样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染，干扰实验结果。样本前处理需配制：配液1：将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶液+1份去离子水，用于样本提取后的复溶)（a）组织 (鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法1、 用均质器均质组织样本；2、 称30.05g样本于离心管中，加入6ml乙酸乙酯，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；3、 取出2ml上层液体在50-60下氮气/空气吹干或旋转蒸发仪蒸干4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡30s，室温4000r/min以上离心15min。5、 取50 l下层相用于分析。样本稀释倍数：1 （b）蜂蜜1、 取20.05 g蜂蜜，放入离心管中，用4ml2、 去离子水溶解；3、 加入4ml乙酸乙酯上下振荡5min；4、 室温4000r/min以上离心10min；5、 移取1ml上层乙酸乙酯（相当于0.5g样本）到另一离心管中，50-60氮气流下干燥；6、 用0.5ml稀释后的复溶液溶解，混合30s；7、 取50l用于分析。8、 样本稀释倍数：1 检测下限：0.5ppb9、 定量下限：1.5ppb 六、 酶标免疫分析程序 测定前应须知：1、 使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25）。2、 使用之后立即将所有试剂放回2-8。3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。4、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。操作步骤1、 从4冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8。3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、 加标准品/样本 50l/孔到各自的微孔中，然后加抗体50l/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25环境中反应60min。6、 取出将孔内液体甩干，用洗液250l/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。7、 每孔加入酶标记物100l，盖板膜盖板后置25环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。 8、 显色：每孔加入底物A液50l，再加底物B液50l，轻轻振荡混匀，25环境中避光显色30min。9、 测定：每孔加入终止液50l，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。七、 结果判定所测得的标准液和样品吸光度的平均值除以第一个标 准液（0标准液）的吸光度值再乘以100，得到百分吸光度值。0标准液的百分吸光度值等于100%。标准液的吸光度值（或样品）-100 = %吸光度值0标准液的吸光度值以标准品浓度的以10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含AOZ的量。 若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。八、检测方法灵敏度、准确度、精密度 试剂盒灵敏度：0.5ppb 样本最低检测限：蜂 蜜 1.5ppb鸡肉/鸡肝、猪肉/猪肝、虾、鱼0.5ppb 回收率： 鸡肉/鸡肝、猪肉/猪肝、虾、鱼90%10%蜂蜜85%10%精密度： 试剂盒的变异系数均小于10%九、注意事项1、 室温低于20或试剂及样本没有回到室温（20-25）会导致所有标准的OD值偏低。2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、 试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、 不要使用过了有效期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。6、 将不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、 试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表