植物组织器官培养技术.ppt

第四章 植物组织器官培养技术,植物组织培养包括根、茎、叶、叶柄、花器、茎尖、幼胚、花药、花粉、果实等的无菌培养。 1. 植物快速繁殖及脱毒技术 2. 花药及小孢子培养 3. 植物胚胎培养 4. 植物的离体受精 5. 组织培养常见问题及对策,1.植物快速繁殖及脱毒技术,一、基本概念 离体无性繁殖(propagation in vitro) ：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称之为微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation）。是生产中广泛应用的职务细胞工程技术。 单株无性系或单芽无性系：用上述方法得到的植株群体来自一个单株或单芽，他们的遗传组成相同，称为单株无性系或单芽无性系,芽（单芽、丛芽）,植物脱毒（virus elimination）：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。 是生产实践中广泛应用的植物细胞工程技术。 体细胞胚或胚状体（embryoid)：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。,其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，区别于无融合生殖胚； 其二，体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚； 其三，体细胞经过了胚胎发育过程，区别与离体培养中器官发生直接形成个体的途径。,繁殖系数（breeding coefficient）：也叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数,二.研究意义,（1）繁殖速度快，经济效益高 （2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗， （3）保持植物种性（保持其优良基因型） （4）繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。,三、离体无性繁殖的程序,（1）无菌培养物制备（启动培养） （2）培养物的增殖（解决繁殖问题） （3）生根培养（为移栽作准备） （4）炼苗（为移栽作准备）和移栽 （5）再生植株的鉴定（确保繁殖的个体没有发生变异/退化）,芦荟的植物组织培养过程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,（1）无菌培养物的建立 无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择外植体灭菌接种培养等基本过程。,（2） 培养物的增殖 腋芽增殖； 不定芽增殖； 胚状体增殖; 愈伤组织增殖； 原球茎增殖（比如兰花，类似的还可以用“试管薯”繁殖脱毒的马铃薯苗） 上述红色的三种方法繁殖比较稳定，不易产生变异。,腋芽增殖,特点：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。目前采用这一方式快速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、月季等。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。 （why?）体细胞无性系变异,腋芽增殖,特点：繁殖系数高，非洲紫罗兰用常规叶插法，每片叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植株。遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。 诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织。以保证繁殖品种的遗传稳定性。,不定芽增殖,分离,特点：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子，artificial seed)，这一途径还没有用于快繁技术。,胚状体增殖,愈伤组织增殖,所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织培养技术的所有过程(愈伤组织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整植株)，它属于真正意义上的组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。 特点：成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁,原球茎增殖 细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。 与原球茎繁殖相类似的还有马铃薯的“试管薯”的生产也是快繁的一种方式，是目前马铃薯脱毒苗繁殖的主要方式。,（3）生根培养,生根是获得完整植株的关键。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。 促使试管苗生根的方法通常有两种。 一种是在固体培养基（生根培养基）上诱导生根。当试管苗长到23厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定） 。 另一种是激素浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的ms培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。,生根困难的处理办法,一些难生根的植物用生长素加黑暗处理效果好。糖含量、大量元素浓度减半，或用低盐培养基。另外也可以将无根小苗直接嫁接到根系良好的砧木上。或者培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。,（4）炼苗和移栽,试管苗的生长环境 无菌 异养 高温 弱光 恒温 因此苗弱，要炼苗,试管苗的特点（弱点）,1.形态解剖方面 （1）根：无根毛。根与茎的输导不相连。 （2）叶：叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。无表皮毛，保水和反光能力差。叶细胞结构疏松。叶气孔突出，张大。叶存在排水孔。 2. 生理功能方面 根的生理功能低。 叶片表面极易散失水分 气孔不能关闭叶光和能力较低，co2固定能力差。,克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施,a、移栽要抓三个关键 水分的平衡（不要失水过多） 温度和光照（不能太高） 光和能力逐步形成或加强 b、提高移栽成活率的技术措施 移栽前的工作 移栽时应注意的问题,移栽前的工作 a、培养瓶生壮苗 加入生长控制剂，如多效唑， b9（丁酰肼）， ccc（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。,b、炼苗 将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为1030d。,移栽时应注意的问题,a、防止菌类滋生 苗底部培养基要洗干净 杀菌剂处理苗的根部 定时用杀菌剂处理种植基质 常用杀菌剂：kmno4,百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1,b、保持小苗水分供给平衡,在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件（90%），使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当57d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。,c、移栽时选择合理的种植基质 基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭、锯木屑等。,泥炭 珍珠岩 椰糠,蛭石,锯木屑,d、注意一定光照，温度条件,试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是1820 ，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。,（5）鉴定,再生植株的鉴定是指用细胞学或形态学等方法检查再生植株是否有遗传变异。,（二）、应用领域,珍稀植物资源和育种原始材料，如工程植株、果树芽变分离 经济效益高，但难于繁殖的植物，如名贵花卉、 用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。 用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。 繁殖销量大，但用常规的方法难以满足数量上需要的植物，如草皮。,四. 植物的脱毒技术基本原理,当前脱除植物病毒的方法有：1、茎尖培养脱毒法；2、热处理脱毒法；3、微体嫁接（主要用于果树）离体培养脱毒法；4、珠心组织培养法；5、愈伤组织脱毒 （一）、茎尖脱毒 1、茎尖脱毒的依据。 病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。,2、茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 （1）、被脱毒植物携带病毒的诊断及其在体内的分布 在脱毒之前，应了解植物携带何种病毒，病毒在体内的分布位置，以确定培养茎尖的大小,（2）.母体植株的选择和预处理 母体的选择： 欲脱毒材料的品种典型性：关系到脱毒以后的脱毒苗是否保持原品种的特征特性 植体健康程度选择：应选感病轻、带毒量少的健康植株作为脱毒的外植体材料，这样更容易获得脱毒株。,外植体预处理： 香石竹在3840条件下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在3538的条件下处理60天可使病毒失活。 马铃薯在37条件下处理1020天能除去卷叶病毒。 柑橘速衰病毒/黄化病毒40/30条件下处理712周。 鳞皮病毒需要在40/30条件下处理8周。 啐叶病毒需要在50条件下处理322小时。 洲青果病毒在50条件下处理3040分钟。,（3）、茎尖的剥离 在切取外植体之前茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、蒜和马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠或升汞表面消毒10分钟。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。,在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下（840倍），一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1-2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。,将接种好的茎尖置于25左右的温度下。每天以16小时 2000-3000lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。 继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。,（4）. 脱毒效果检测 a 指示植物鉴定(indicator test plants) 所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。 每种病毒都有自己敏感的植物，例如： 马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼佗罗 大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠 菊花病毒：矮牵牛、豇豆,千日红,矮牵牛,指示植物鉴定病毒的方法 a、摩擦接种法： 取培养植株的叶片置于研钵中，加入少量的水和等量的0.1mol/l磷酸缓冲液（ph 7.0），磨成匀奖，将其涂抹在指示植株叶片上，在指示植物的叶片撒上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片表皮细胞而又不损伤叶片。5分钟后用清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫网罩的温室内。然后视其病斑的有无，来判断是否脱除了病毒。 例如：植物液接种后如使千日红叶片枯斑，黄花烟、心叶烟呈花叶，证明该植物体内具有马铃薯x病毒,b、嫁接法,有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播的。这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植株的病症来判断是否脱除了病毒,b 血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(elisa)。,病毒感染,人工注射 异体蛋白,动 物,动 物,植 物,带该种病毒,血清反应,（抗体） （抗原）,免疫球蛋白,a、试管沉淀反应,在抗原-抗体最适比例的条件下，观察有无沉淀的产生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀反应操作简单，需注意的问题： 、叶绿体的自发凝聚 可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去叶绿体，ph 保持在6.5-8.5） 、抗原抗体的比例要适当，当抗原过量时回抑制沉淀的形成,b、免疫双扩散,在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个优点：一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。 步骤： 倒胶，一般厚2mm 打孔，多打成梅花型 加样，加血清和汁液。 一般加样后在37恒温过夜，即可进行结果观察。有扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株,c、酶连免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,elisa） 它是将抗原、抗体的免役反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然后将它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同时测定多个样品。,c 电镜检查法 采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确又有效，但需要有一定的设备和技术。,人t淋巴细胞电镜照片,d dna技术检测 例如rt-pcr（reverse transcription-polymerase chain reation）将待测的样品的总rna与cdna合成的试剂盒进行反应，合成cdna，然后利用病毒dna特有的序列设计引物进行pcr反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达,脱毒苗的离体保存与繁殖:一般是在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如b9和矮壮剂可2-3个月继代一次，也可放到液氮或4冰箱中保存 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染,(5).脱毒苗的保存与繁殖,（6） 影响脱毒效果的因素 母体材料病毒侵染的程度:单一病毒感染的植株脱毒较容易,而复合浸染的植株脱毒较难 外植体的生理状态:顶芽的脱毒效果比侧芽好,生长旺盛的芽比休眠芽或快进入休眠的芽好 起始培养的茎尖大小:不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好,带1-2个可获得40%脱毒苗,茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响,(二)热处理脱毒法 1、原理 病毒进入植物细胞后，随植物细胞的dna一起复制。热处理不能杀死病毒。只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去浸染能力。 热处理是一种物理效应，可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。,依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。,2、热处理方法 （1）温水浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50左右的温水中浸渍10分钟至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。（利用较早，二十世纪二十年代对甘薯一种病毒脱除效果较好。5052温水浸渍30分钟）,（2）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35-40。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于38下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培养结合36处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒，亦可采用变温法，如马铃薯每天40处理4小时，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持了芽眼的活力。,热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说，对于球状病毒和类似纹状病毒以及类菌质体所导致的病害才有效；对杆状和线状病毒的作用不大。因此热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。,（三）微体嫁接离体培养脱毒法 木本植物茎尖培养难以生根形成植株，可以采用此法。将极小的茎尖（0.14mm-1.0mm）作为接穗嫁接到种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。接穗在砧木上易成活，且去除病毒几率大，故有可能获得无病毒苗。 点接法的具体操作： （1）砧木苗的培养：采集充实无病的种子，漂洗晾干低温处理后进行表面灭菌，在无菌条件下接入固体培养基中，每试管2-3粒种子，27恒温暗培养10-14天的白化苗，即可作为小砧木,（2）接穗的准备与嫁接：摘去叶片促使枝条绽发新芽，待芽长到0.5-1cm时即可做接穗。表面灭菌后，在无菌条件下借助解剖镜切取0.1-0.2mm的茎尖作接穗；切去砧木苗的顶端，以根部和1cm的上胚轴做砧木，在其顶端用刀尖切1-2mm的切口，将接穗垂直而无损的镶进小切口，然后将其移入适合接穗生长的液体培养基中培养,（四）珠心组织培养法 柑橘类除合子胚外还有多个珠心胚。珠心组织与维管系统没有直接联系，而病毒一般认为是通过维管组织传播的，因此珠心组织培养可获得无病毒植株,（五）愈伤组织脱毒 植物各种器官和部位组织经诱导可产生愈伤组织，再分化培养产生芽，最后产生小植株，其中有可能得到无病毒小苗。这一脱毒途径已在马铃薯、天竺葵、大蒜、草莓等植物上获得了成功。通过愈伤组织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能： （1）病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。如烟草、康乃馨产生的愈伤带病毒和不带病毒的愈伤组织颜色不同,（2）有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰退或丢失 （3）愈伤组织产生抗性变异细胞。,2.花药及花粉培养 一. 花药培养（anther culture） 二. 花粉及小孢子培养(microspore culture),一、花药培养,1概念 花药培养(anther culture):把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株(有单倍体植株)的过程.,tobacco anther with developing haploid plantlet, arising from the microspore,2、花药培养的基本程序是： 外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养-移栽,（1）外植体的选择 基因型的选择（品种的选择） 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。 同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。 因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。,供试材料的生理状态 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。,花粉的发育时期 四分体 小孢子 单核花粉 双核花粉 最适期 涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药为好。小麦已单核中、晚期效果最好。,在花药培养中，如果每次取材时都要进行花药发育时期观察是很不方便的，一般是在试验之前，对花药的发育时期和其相对直观的生长发育特点进行相关研究，通过直观的对应性状来确定花粉的发育时期，如花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠展开程度、旗叶与倒二叶之间的距离等的关系，然后根据这些直观特征判断花粉发育时期，取材。例如： 柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期 马铃薯在花冠漏出萼片一半时大多数处于单核晚期 烟草则在花冠漏出1/3-1/2，花冠和花萼等长时为花药培养的最佳时间。 小麦：幼穗中部在倒二叶的叶耳的上下1厘米之间。,花粉发育时期的镜检方法 a、醋酸洋红法 将花药放在载玻片上，加一滴1%的醋酸洋红（于100ml煮沸的45%醋酸中缓慢加入1g洋红，回流煮沸8h于50下过滤即得），用镊子把花药捣碎，加盖玻片后在显微镜下检查。茄科、禾本科的大多数植物的花药均可用此法，但水稻、番茄、芸苔属和许多木本植物的花药细胞核不易着色，可采用桔花青-铬矾法,b、桔花青-铬矾法 将花药先在卡诺固定液固定20min，然后取出放载玻片上，加桔花青-铬矾染色液制片和镜检。细胞核染成黑色。 桔花青-铬矾染色液的配方： 将5g铬明矾（k2so4. cr2（so4）3.24h2o）加入100ml蒸馏水中后加1g桔花青混匀，加温至沸腾，并煮沸5min，冷却至室温过滤，并加蒸馏水至100ml。,(2)花药预处理 为了提高花药培养的成功率，需要在接种前对实验材料进行各种预处理，已经证明有效的预处理方法有： a 低温预处理 低温预处理可以明显提高花粉胚的诱导效率。但各种植物要求的温度和处理时间有差异： 烟草 79 7-14天 水稻 10 1014天 柑橘 3 510天 马铃薯4 2天,低温预处理的作用机理，学者们提出以下几点： 1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。 2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。 3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。 无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生率。,b 热处理 在一些物种中（芸苔属），将花芽或完整植株在30下处理24h或40下处理1h，能够刺激花粉的胚胎发生。或者接种以后将其放在高温下处理3-8天，可以显著提高花粉植株诱导率。已在小麦，甜椒中得到应用。,c、离心预处理 tanaka将单核后期的烟草花药在10000-11000r/min的速度下离心30min，产生小植株的频率从30.5%提高到38.2%,d 乙烯利预处理 培养基中较低浓度的乙烯利（40mg/l）对花粉愈伤组织的形成有明显的促进作用。可能原因促使花粉的分裂。,e 甘露醇预处理 将花药在0.3mol/l甘露醇溶液预培养3-5d，可以提高花粉胚的诱导率。重蒸水表现出与甘露醇相似的结果。这可能是由于这种处理方式使小孢子处于碳饥饿状态，导致花粉从正常发育途径转向雄核发育途径。,(3)外植体的消毒 挑出适宜培养的花蕾或幼穗，一般先将花蕾或幼穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中浸泡3-5min，用无菌水冲洗3-5次。如果花蕾包裹严密，内部一般是无菌的，比如小麦，只需用沾有70%酒精的纱布对叶鞘进行表面擦拭就可达到灭菌的目的。,（4）接种 将消毒过的材料置于超净工作台上，无菌剥取花药进行接种，在剥取花药时，应注意在整个操作过程中尽可能避免花药受到损伤，否则常常会刺激花药壁形成愈伤组织，如果是花药较大的材料，可用镊子剥开花蕾，夹住花丝，取出花药。如果花器很小，则可以借助解剖镜夹取花药，或只把花被去掉，将其余部分接种在培养基上，接种时尽量减少花药在空气中的暴露时间。,（5）培养基及培养条件,培养基 花药培养常用的基本培养基：h 、c17、ms（murashigc & skoog，1962）；nitsch(nitsch，1969)；n6(朱至清，1974)；b5(gamborg et al.，1976)。 附加成分：蔗糖, 植物生长调节物质。,培养条件温度和光照 温度：不同植物对温度的要求不同，如:柑橘在20以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到2125时便会有胚状体形成，而当温度提高到26以上时又完全不能形成胚状体。 油菜若将接种后的花药在30条件下培养23天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33条件下培养35天，可提高成愈率和绿苗率。 光照：先弱后强,（6）移栽 移栽看来容易，其实不然。例如小麦等越冬作物，花粉植株生长至适合于移栽的大小时，适值盛夏，自然气温很高，按期移栽很难成活，应当在4冰箱中冷藏越夏。9月底将试管苗取出在自然光下炼苗5-7d，然后洗净琼脂，进行移栽，移栽后在苗床上搭盖塑料薄膜棚。 移栽前如果根系不发达，可以将试管苗的老根剪除干净，移入生根培养基中诱导生根。,（7）花粉植株的倍性及染色体加倍技术,花粉植株的倍性鉴定，最可靠的方法是对茎尖或根尖细胞进行染色体记数。 染色体人工加倍最有效的方法是用一定浓度的秋水仙碱处理单倍体植株的生长点或分蘖节。 对于烟草等双子叶植物来说，将具有3-4片真叶的试管苗置于灭过菌的0.4%秋水仙碱溶液中浸泡24-48h，用无菌水洗净后在接种于新鲜培养基中，可使25%左右的单倍体幼苗加倍成为二倍体,禾本科植物在分蘖期，将花粉植物从土壤中挖出，洗净根部泥土，浸泡在含有1%-2%二甲基亚砜秋水仙碱溶液中，注意一定要将分蘖节没入药液中。不同植物处理浓度和时间不同，小麦：0.04% 8h 水稻：0.2%24h，处理期间的温度最好保持在8-15，处理后用流水冲洗数小时，重新移栽。, 基因型 发育时期 植株的生理状态 预处理 培养基和培养条件 花药的接种密度（密度效应） 培养的方法与方式：固体培养、液体培养（ficoll）、双层培养、分步培养、条件培养,3 影响花药培养的因素,固体培养,anther and haploid plantlets on a solid medium containing activated charcoal,a、液体培养法 液体培养液层0.5mm左右，可以加入一些ficoll作为漂浮剂，使花药全部不下沉而漂浮在液面上，这样通气良好，提高了培养效果，要注意及时转移沉于瓶底部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养的效果 液体培养具有一定的优越性： 在液体培养中不存在位置效应；可以在培养过程中补加新鲜培养基和重新调整培养基的成分；液体培养有利于花粉粒的释放及分裂形成愈伤组织 但如何掌握转分化的时期等细微环节直接影响到花药培养的效果,anther and haploid plantlets on a liquid medium containing activated charcoal,b、双层培养 在35mm*10mm的小培养皿中铺加一层（1ml）琼脂培养基，固化后，在其表面再加入0.5ml的液体培养基。 优点在于： 花药在培养的早期可以从活性高的液体培养基中汲取营养，花粉胚长大后又不会沉没，可以在通气良好的条件下分化成植株。,anther and haploid plantlets on a double layer medium. the solid lower part contains charcoal while the upper liquid layer contains the growth regulators,c、条件培养基培养 用预先培养过花药的液体培养基再次进行花药培养，可使花药培养效率大大提高。条件培养基不存在种的特异性，例如培养过小麦花药的培养基对大麦同样有效。,4、花药培养中单倍体形成的途径,a、通过胚状体形成单倍体植株 b、通过愈伤组织形成植株 高浓度生长素产生愈伤组织，低浓度利于胚状体的诱导。 通过愈伤易产生混倍体,马铃薯花药培养中胚状体和愈伤组织的倍性,5、花药培养的意义,a、缩短育种年限 常规育种，杂种f2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到f5f6代能得到纯合后代。 用花药、花粉（n）培养，得到单倍体植株，染色体加倍后，获得纯合二倍体（2n）。这样，从杂交到获得纯合株系，只需二个世代。因此，可缩短育种年限34个世代。,b、提高选择效率,f1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广泛的变异类型。并且隐性基因可以得到充分表达。单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物。因此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。,6、现阶段花药培养存在的问题, 诱导频率低。频率最高的烟草也只有30%，低的只有百分之几，千分之几 体细胞（花丝、药壁、药隔）干扰问题 倍性变异 药壁毡绒层细胞对花粉发育的作用，如何用合成培养基代替毡绒层的作用，还不十分清楚，目前培养基成分带有一定的盲目性。 白化苗问题,二.花粉及小孢子培养,1、概念 花粉培养(pollen culture):也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.,优点（与花药培养比）： a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。 b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。 c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。,2花粉培养的一般方法 预处理或预培养 要取得花粉培养的成功，必须在分离花粉前，先对花粉进行一定时间的预处理或预培养。,花粉粒的游离 分离花粉粒，应达到以下标准 a：成活率较高，发育齐整b：达到一定的数量c无菌，无杂质 常用的分离方法有： a 是自然散粉法 a 固体培养 把花药从未开的花中在无菌条件下，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，使花粉继续培养生长。,b 液体培养 这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到培养基中，过筛再除去花药壁等，离心收集花粉将其重新培养在新鲜培养基上。,b 机械分离花粉粒 a：挤压法。 此方法是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集悬浮液，然后用30蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。 注意 （a）挤压时用力要适当而且均匀（b）选用合适的筛网孔径（c）分离液的渗透压要合适,b、搅拌器或超速旋切机法 将小花放在含有一定培养液的微量搅拌器中，在高速条件下搅拌一定时间，匀浆用筛网过滤，滤液在1000g离心，用培养液洗涤数次，用percoll（包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒） 密度梯度离心收集花粉,看护培养（nursery? culture） 概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。,培养方法,条件培养(condition culture) 双层培养,3、影响花粉培养的几个关键 与其他器官的培养技术相比，花粉粒培养还不成熟，影响培养的效果可能很多，要非常系统归纳还不可能，简述： a、在培养前分离的花药应多次洗涤，否则其生长和形态发生将受影响，不洗涤的花粉不能生长或只能形成愈伤组织 b、冷处理(低温预处理)已广泛用来提高花粉雄核发育的频率 c、培养基中增加蔗糖和肌醇（在很多种培养中都具有较好的作用）的浓度能明显提高雄核发育的频率。,3.植物胚胎培养,3.植物胚胎培养,胚胎培养(embryo culture)是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。 胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括： 受精以后的胚珠子房培养:研究胚胎发育等 未受精胚珠和子房:诱导单倍体植株、离体授粉等 胚抢救技术（embryo rescue）：获得远缘杂种,胚胎培养的意义和类型,克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 打破种子休眠，缩短育种年限。主要有以下两种： 使种胚发育不全的植物获得后代。例如天麻、兰花种子成熟时，胚只有6-7个细胞，利用离体培养可以打破休眠提早萌发 使含抑制性物质不发芽的种胚发芽。苹果属离体胚培养48h即可萌发，而用种子则要9个月 使生活力低下或无生活力的种子萌发 许多落叶果树，特别是杂交种产生早熟、生活力低下甚至无活力的种子，利用胚胎培养可使种子萌发，提高萌发率。例如桃、芭蕉、芋等,使柑橘类植物合子胚正常发育 这类植物种子内存在大量的珠心胚，珠心胚生活力很强，因而往往得不到合子胚后代，影响杂交育种结果，利用胚培养可以尽早取出合子胚/有性胚进行培养，从而获得杂种后代 获三倍体或单倍体植株 因被子植物胚乳细胞大多为三倍体，胚乳培养可以获得三倍体植株，从而使植物胚胎培养成为一种新的育种途径，用于果树、瓜类等经济作物产生无子果实。 另外，对远缘杂种的胚进行培养时，可以通过染色体消除（chromosome elimination）获得单倍体 快速繁殖特殊植物(椰子，山楂） 用于基础研究 研究胚胎发育过程、胚胎发生的条件以及影响因素，胚乳生长发育及形态建成过程,一. 植物胚培养(embryo culture of plant),1、胚培养的概念与类型 概念：在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法,（1）成熟胚培养,成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。因此时的胚已具有萌发能力，故称为成熟胚培养。 培养较易成功。相当于种子萌发，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。 由于种子外部有较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。,（2）幼胚培养,幼胚是指子叶期以前的幼小胚。 由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。 胚抢救(embryo rescue)，在作物远缘杂交中广泛应用。 随着组织培养技术的不断完善，幼胚培养技术也在进步，现在可使心形期胚或更早期的长度仅0.1-0.2mm的胚生长发育成植株。现在幼胚培养成功的有小麦、大麦、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。 禾本科植物中常用此法诱导胚性愈伤组织。,禾本科植物通过幼胚培养产生胚性愈伤组织，进而形成再生植株,2幼胚培养 (1) 幼胚培养的关键技术： 取材 取材时期：1、大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体） 2、以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。,(a) globular (b) heart shaped, (c) torpedo,胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。1、幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。2、胚柄积极参与幼胚的发育，特别是球形期以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。3、另外胚柄促进幼胚离体生长的作用能被浓度为5mg/l的ga3有效取代。, 幼胚剥离,剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。 是否需要特殊处理?, 培养条件的控制, 胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。,（2）幼胚离体培养的生长发育方式, 早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发（未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟萌发）。 1、在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株。 2、但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞/胚性愈伤组织，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。, 愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。,（3）离体幼胚培养的影响因素, 培养基 胚的成熟程度不同，所用培养基的类型也不同。成熟胚的培养基有：tukey、white等。未成熟胚有：rijven、nitch、ms等。 培养基的渗透压对幼胚培养至关重要，渗透压的调节主要依赖糖。常用的是蔗糖，不同发育时期的胚要求蔗糖的浓度不同，胚龄越小糖浓度要求越高。 确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后放入若干浓度的蔗糖溶液中，观察质壁分离现象，以确定等渗溶液的浓度。, 附加物： a、aa类，无论是单一的还是复合的aa都能刺激胚的生长。最有效的是gln，常用的有gly、ala、glu、asp。ch（水解酪蛋白）是一种aa复合物，有抑制早熟萌发和促进未成熟胚发育的作用 b、维生素类。维生素对初期幼胚一般是必需的，但有时也有抑制作用，最好在实验证实后使用。 c、天然提取物。常用各种胚乳汁、酵母提取物 d、生长调节剂, 环境条件 对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜，幼胚启动发育后给予和其自然光周期一致的光照条件有利于幼胚发育。 培养的温度一般以该植物种子萌发的适宜温度为好。, 培养材料 植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚培养有重要影响。显然，材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。 胚发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。,二.子房培养(ovary culture),子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。 授粉前子房培养(unpollinated ovary culure)是为了获得孤雌生殖的单倍体植株，适用于那些胚囊分离特别困难的植物； 授粉后子房培养适用于那些获得种子特别困难，胚分离不易操作的植物，以获得种子或果实或植株。,1材料的选择 （1）品种间的差异 （2）胚囊发育时期：以八核胚囊和成熟胚囊期的子房培养具有较高的诱导频率。,大麦胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性,2培养基 （1）基本培养基 不同培养基对于子房培养产生愈伤组织的诱导率有直接影响，比较常用的培养基是n6、b5、ms，禾本科作物以n6培养基较常用，其它植物则多用ms和b5。,（2）植物生长调节物质的影响 未授粉的子房培养必须加入适宜种类和浓度的植物生长调节物质 （3）蔗糖浓度 蔗糖浓度多在310之间，因不同植物材料而异，一般是诱导培养阶段蔗糖浓度要高一些，分化培养时蔗糖浓度要低一些。,3.接种方式 主要考虑两个方面的问题：极性；营养吸收 花柄直插比平放效果好,三.被子植物胚乳培养( endosperm culture),1概况 胚乳培养的研究主要集中在以下一些问题的探讨： a、胚乳细胞的全能性。 b、能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实； c、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。,triticum grain,到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。,plantlets arising from isolated endosperm tissue,2植物胚乳的发育特性 植物胚乳可以分为两大类：被子植物胚乳和裸子植物胚乳。 被子植物胚乳是双受精的产物，它由二个极核和一个雄配子融合形成，所以，在染色体倍性上它属于三倍体组织。 裸子植物胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此它属于单倍体组织。,3影响胚乳培养的因素 （1）胚乳的发育时期： 胚乳发育时期大致可分为早期、旺盛生长期和成熟期。旺盛生长期为最佳时期，这时的胚乳细胞处于细胞形成期并保持旺盛的分裂能力。 几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后天数 玉 米 8-12天 大 麦 1012天 黄 瓜 716天 小黑麦 714天 （2）基因型,（3）培养条件：常用培养基是ms和white，常需要附加ch和酵母提取物。在诱导期一般需要高浓度的生长素、较高的ph，分化期需要较高浓度的细胞分裂素。 （4）胚因子：胚对胚乳的培养有一定的影响,4胚乳培养的形态发生 愈伤组织形成 最适发育时期的胚乳在离体培养条件下经过一定时间即可形成愈伤组织。 直接进行器官分化,4. 植物的离体受精 一、离体受精的概念和意义 从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称为离体受精，或试管受精。 离体受精技术在克服自交不亲和性和远缘杂交障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后不能进入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合方面有着极其重要的意义。另外，试管受精技术也为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径。,二、离体受精的方法 （一）收集花粉 参照花粉培养 （二）剥取子房或胚珠 做母本的花蕾在开花前数天去雄并套袋，开花前一天取花蕾在实验室进行常规表面消毒之后，在无菌条件下剥取胚珠（带胎座或不带胎座）或子房培养。,（三）离体受精的方法 1、子房试管受粉 直接引入法 无菌条件下用锋利的刀片将子房壁或子房顶端切开一个小口，把花粉悬浮液直接滴入切口后进行培养。 注射法 用无菌注射器吸取花粉悬浮液，从子房基部或上端切口注入子房，基部切口可用凡士林封口，然后接种于