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辅酶Q10的生产制备工艺的研究进展作者：谢伟 指导老师：陶志杰摘 要:本文综述了辅酶Q10的生产制备工艺，并且分别介绍了辅酶Q10的结构特点和生理功能，及其制备方法，并着重介绍了微生物发酵法，阐述了其生产辅酶Q10的生产菌种，以及能提高辅酶Q10产量的基本方法，最后提出了今后对辅酶Q10的研究和发展方向。关键词:辅酶Q10；生理功能；制备方法Coenzyme Q10 Production Preparation Technology Research Progress Author:Xie Wei Tutor:Tao ZhijieAbstract: The paper summarized preparation process coenzyme Q10 production are introduced, and the structural characteristics and coenzyme Q10 physiological function, and preparation methods, and emphatically introduces microbial fermentation, expounds its production coenzyme Q10 production, and can improve the basic method of production coenzyme Q10，finally the future of the research and development of coenzyme Q10 direction.Key word: Coenzyme Q10；Physiological functions；Preparation methods0 前言近年来，我们经常可以看到科学家们在不断预测人类的寿命极限：120岁、150岁甚至有美国科学家预测本世纪末我们能活到200岁。这些预测，让很多人产生了这样的疑问：人类到底能活多久？在科学理论上，从细胞分裂次数与分裂周期测算法推算，人类最高寿命至少是120岁；从性成熟期测算法推算，人类的最高自然寿命应是112-150岁；从生长期测算法推算，人类的自然寿命为100175岁；从怀孕期测算法推算，人的自然寿命最高可达167岁。以上方法推算结果表明，人类正常的自然寿命也都在100岁以上。那么什么因素决定我们人类的寿命呢？寿命取决因素很多。常规的说法为：首先是家族遗传，如果家庭长辈里有长寿的，后代就有长寿基因；其次时生活环境，污染少的地方人肯定比污染重的地方人长寿；三是生活方式，良好的饮食习惯能使人长寿；四是适当锻炼，生命在于运动，但要因人而宜，因时而宜。破解生命密码，揭开长寿之谜。目前生命科学家终于有了惊人发现，原来决1定人类长寿与否的根本原因，就是一种叫做辅酶Q10的物质，它具有逆转抗衰、延年益寿之独特功效，被誉为“长寿因子”、“生命之源”。由此可见，开发生产辅酶Q10这一产品具有广阔的市场前景。1 辅酶Q10辅酶Q10又名泛醌10，是一种脂溶性醌,其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链聚异戊烯基的聚合度为10而得名，是一种醌环类化合物。化学名 2-(3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-癸甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基)-5,6二甲氧基-3-甲基-p-苯醌 拼音名 FUMEI Q10 英文名 COENZYME Q10 结构式 辅酶Q10分子结构分子式 C59H90O4 分子量 863.36辅酶Q10受光照易分解，而受温度、湿度影响则较小。辅酶Q10在脏器(心脏、肝脏、肾脏)、牛肉、豆油、沙丁鱼、鲭鱼和花生等食物中含量相对较高。摄入大约1斤沙丁鱼、2斤牛肉或3斤花生可分别提供约30mg辅酶Q10。辅酶Q10是1957年被发现，1958年被卡鲁福鲁卡斯博士认定了化学结构，并且获得了美国化学学会的最高荣誉Priestly Medal。被称为辅酶Q10的研究之父，当时他提出辅酶Q10对心脏机能起着重要的作用。在实际生活中，卡鲁福鲁卡斯博士40年来一直服用辅酶Q10，直到91岁去世为止，他一直都是现役教授精力充沛的从事科研活动。2 生理功能2.1 心脑的保护神辅酶Q10对心血管系统具有抗氧化性，使其在动脉粥样硬化的形成和发展过程中具有很好的抑制作用，不但能改进心肌的代谢，治疗由冠状动脉窄化所造成的胸腔痛，还能减少心绞痛的发生，加强心脏的跳动功能，治疗充血性心脏衰竭，2是防治心脏最佳奇迹营养素，尤其在治疗心脏衰竭、心脏无力上疗效特佳。最近阿根廷神经科学研究所研究显示，辅酶Q10在大大地促进心脏健康的同时，还可以显著保护大脑，增强大脑活力。2.2 降压的新曙光 1 辅酶Q10可增加ATP的合成，清除自由基而降低血管过氧化状态，减少内皮细胞和血管平滑肌细胞的超氧化物，保护并减轻血管内皮细胞损伤，降低胞浆NADH水平，促进血管内皮细释放NO、PGI2，舒张外周血管并降低外周阻力，从而起到降压作用。2.3 衰老的防火墙 辅酶Q10是人类的长生因子，能够增强免疫系统，保护心、肝、肾的功能，免受自由基损害，从而为人们的健康长寿提供保证。 （1）强而有力的抗氧化剂，对延缓人体老化效果显著； （2）强化免疫力，消灭侵入体内的病菌； （3）有效改善肌肤灰暗、黄气、色素沉淀问题； （4）能激活人体细胞和细胞能量，具有提高人体免疫力、增强抗氧化能力、延缓衰老和增强人体活力。2.4 精神的原动力 辅酶Q10是人体自行合成的营养素。其合成量会在我们年届20岁之后便持续降减，到了50岁时，我们体内的辅酶Q10数量会比20岁时减少50%，年届70岁时则减少60%。人体的Q10产量也会因为种种不利因素而进一步衰减。 辅酶Q10能够加速细胞更新，激发细胞活性，从而大大促进细胞摄取营养的能力，为人的精神活力添加源源不断的动力支持。因此，辅酶Q10被专家誉为“生命的加油站”。2.5 癌症的新克星 临床研究表明，辅酶Q10有抗肿瘤作用及免疫调节作用，对防治癌症，慢性感染、念珠病菌，爱滋病病毒，大有助益。丹麦的研究已表明，辅酶Q10在与某些癌症作斗争中也确有疗效。在涉及到32位乳腺癌患者的试验中，用大剂量辅酶Q10加到常规的治疗中，显示出较高的补充的有益的作用。在试验中，肿瘤没有退化的两位患者，当他们的辅酶Q10剂量分别增加到390mg/day，结果他们的肿瘤在三个月内完全地消失。辅酶Q10的补充对于经历象阿霉素和thralines这样的心脏毒性药物的化疗的癌症患者也很重要。3 制备方法 3目前辅酶Q10的制备方法2主要有：生物提取法、化学合生法和微生物发酵法3种。3.1 生物提取法 生物提取法是制备辅酶Q10最传统的生产工艺，也是国内较多采用的方法。原料有动物心肝脏、玉米芽、菠菜等，提取方法有皂化法、溶剂萃取法和吸附层析法3,4。3.1.1 皂化法 2 皂化法分为醇碱皂化法、碱皂化法。将氢氧化钠一乙醇济液或氢氧化钠溶液加人含有辅酶Q10的组织或细胞溶液中，再经过一系列后处理如硅胶吸附、石油醚洗脱等工序，最终获得辅酶Q10产品。3.1.2 溶剂萃取法 溶剂萃取法将原料与特定的溶剂混合，经过滤、萃取、浓缩等过程，得到辅酶Q10产品 。3.1.3 吸附层析法 将原料与乙醇溶液混合，再经正己烷洗脱、浓缩等步骤，可获得辅酶Q10产品。由于生物提取法得到的辅酶Q10是侧链双键全反式构型的天然产物，故易被人体吸收，产品纯度高，质量好；不足之处是动植物中辅酶Q10含量低、各种化学成分复杂、原料来源受限制，因此产品成本高、价格昂贵规模化生产受到了一定的限制。3.2 化学合成法 最早用合成方法得到辅酶Q10的是日本的Nisshin公司。我国也从20世纪7O年代开始进行研究。目前该化合物的合成方法主要分为两类:其一是母核化合物上引人癸异戊二烯醇基，另一种方法是首先于母核化合物上引人较短的侧链，然后再引人所期望的长链。3.2.1 侧链直接引人法 1959年Ruegg R等报道合成辅酶Q10的路线5，虽得到了产物，但产率只有20%，且由于茄尼醇制得的烯丙基化试剂是顺、反异构体的混合物，需分离，因此这种方法的应用受到了限制。1979年Naruta Y等报道了将异戊二烯部分制成锡烷5，利用锡烷的强亲核性与醒反应，并以BF3OEt2作催化剂，在低温条件下反应，最后得到了几何构型较满意的产品(E/Z=85/15),但产率以异戊二烯锡烷计算也只有51%。从以上合成路线可以看出，此类方法都是用母核化合物与聚异戊二烯基化合4物反应，但这一关键步骤产率都不太高。3.2.2 侧链延长法早在于1978年，Terao S就利用辅酶认合成辅酶Q7合成辅酶Q105,因原料辅酶Q7认价格十分昂贵，所以此路线实用价值不大。Mohri M小组对此作了大量的研究，于1986年报道了他们的成果，去(对甲基)苯磺酸基反应中以LiHBEt3作还原剂，以PdCl2作催化剂，产率为86%,Ag2O作氧化剂，产率为94%(E/Z=95/5)5。以上两种方法类似，都先在母核上增加一个异戊二烯，再增加一个由茄尼醇制得的化合物。1988年，Eron D等报道了以香叶醇为原料制备辅酶Q10的全合成路线6,7。该方法路线简单，原料易得，中间体易制备，产率高，是很有前途的合成方法。3.3 微生物发酵法 微生物发酵法是目前认为最具发展前景的辅酶Q10生产方法。该方法生产的辅酶Q10产物活性好，可通过规模放大生产能力。 其技术关键是辅酶Q10产生菌的生产能力及分离纯化方法。由于受菌种、发酵工艺以及下游提取的工艺的限制， 微生物法生产得到的辅酶Q10的产量不高，目前还无法满足工业化生产的要求。 通过诱变育种、构建工程菌、优化发酵工艺、优化提取纯化工艺等策略，能最大限度地提高辅酶Q10的产量，有望实现辅酶Q10的工业化生产。3.3.1 辅酶Q10的生产菌种能够产辅酶Q10的微生物种类较多，真核和原核微生物都能够作为辅酶Q10的生产菌种。所涉及的微生物超过34个属，包括假单胞菌属(Pseudo monasaeruginosa)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、氧化葡糖杆菌属(Gluconobacter oxydans)、英膜红细菌属(R.capsulatus)、浑球红细菌属(R.sphaeroides)、脱氮副球菌属(Paracocus denitrificans)、热带假丝酵母属(Candida tropicalis)和脱氮假单孢菌属(Paracoccus denitrificans)等。这些菌种都可以直接从自然界中筛选得到，但不同菌种的辅酶Q10产量相差较大。Yoshida等8通过摇床培养试验鉴定了34株细菌菌株产辅酶Q10。的情况，其中29株可以产辅酶Q10，并且A.tumefaciens KY-3085,A.radiobacter KY-3086和R.sphaeroides KY-4113所产的辅酶Q10超过60 mgL。3.3.2 提高辅酶Q10产量的基本方法影响辅酶Q10产量的因素较多，一般从自然界中筛选到的野生型菌种产量都比较低，不能满足生产的需要。通常可以利用各种手段对原始菌株进行遗传改造，突破微生物自身的代谢调控机制，从而提高微生物的产量。例如通过选育具有结构类似物抗性、营养缺陷型突变株或将某些关键酶基因进行克隆，构建目的工程菌株。再通过进一步优化生产菌种的发酵工艺从而极大地提高原始菌种辅酶Q10的产量。3.3.2.1 传统诱变育种使用诱变手段对野生型菌株进行基因突变，再通过适当的筛选方法，得到5产量显著提高或者发酵特性显著改善的突变株如营养缺陷型或抗结构类似物突变株等。Yoshida8发现与R.sphaeroides KY-4113相比用A.tumefaciens KY-3085作为辅酶Q10的生产菌株有很多不足，如菌落光滑不易收集菌体，发酵液的黏度大，辅酶Q10产量低。以NTG为诱变剂，A.tumefaciens KY-3085为出发菌株。筛选到了一株菌落粗糙的突变株A.tumefaciens A-9，且该突变株的培养液黏度得到显著改善。再以A.tumefaciens A-9为出发菌株经过诱变，用乙硫氨基酪酸、道诺霉素、维生素K3以及X-gal作为筛选压力筛选到了一系列结构类似物抗性突变株A.tumefaciens M-37，Q-13，AJ-24，AP-37和AU-55，辅酶Q10的产量较原始菌株A.tumefaciens KY-3085均有提高。戚薇等9以土壤杆菌(A grobacterium sp.)TLY24为出发菌株，采用70致死剂量的NTG进行诱变处理，筛选抗辅酶Q10结构类似物维生素K3突变株，定向选育到了2株辅酶Q10高产突变株土壤杆菌R2122和R2015。其摇瓶发酵72 h，辅酶Q10产量分别为57.3 mgL和599 mgL，较出发菌株提高了357和416。此外，芳香族氨基酸的结构类似物以及呼吸抑制剂也可以作为选择压力从突变库中筛选出辅酶Q10产量提高的正突变株8。Choi等10考察了溶氧水平、叠氮化物、二硝基酚以及过氧化氢对AtumefaciensATCC4452胞内辅酶Q10含量的影响。试验发现当限制溶氧水平或者添加电子流抑制剂时均能提高胞内辅酶Q10含量。3.3.2.2 代谢工程育种代谢工程即利用重组DNA技术通过改变细胞内有关的酶活、酶量和输送体系、调节功能，改变细胞的遗传特性以改进微生物某些代谢活性最大限度地提高目的产物产率的一门技术11。代谢工程研究通常包括两部分：一部分是对细胞体系进行系统分析，主要表现为对细胞代谢流，代谢网络及代谢控制分析；另一部分是根据分析结果对目的菌株进行遗传改造，改变代谢流向，开辟新的代谢途径，构建可用于工业生产的优良菌株12。研究发现将辅酶Q10合成途径中的多个酶基因同时克隆到受体细胞中，可以强化辅酶Q10生物合成的代谢流，使得受体细胞合成辅酶Q10的能力得到增强。Zhang等13将来自A.tumefaciens的dps基因分别与来自酿酒酵母的coq2，来自S.pombe的pptl基因以及来自E.coli的ubiA、ubiC基因组成由单一启动子控制的重组质粒，转化到A.tumefaciens中，得到含有4种重组质粒的转化子(pBIV-dps，pBIV-dpsq，pBIV-dpsp以及pBIV-dpsca)。试验发现含有pBIV-dpsca6的重组A.tumefaciens辅酶Q10的产量较其他重组子和非重组子都要高。在微氧补料分批发酵时，含有pBIV-dpsca的重组A.tumefaciens辅酶Q10含量达到了308 mgL，较非重组A.tumefaciens辅酶Q10的产量和产率分别提高了889和777。Zahiri等14将A.tumefaciens的ddsA基因引入E.coli中，得到的重组E.coli在初始pH为70的2YTG培养基上培养，辅酶Q10的产量可以达到470 mg(DCW) g。在此基础上。再通过代谢工程的手段将外源的MVA途径引入大肠杆菌中使得辅酶Q10的产量进一步提高到l 70686 mg(DCW) g。4 辅酶Q10的应用现状与市场前景4.1 辅酶Q10的应用现状2005年，全球辅酶Q10的消费量达300多吨，其中功能食品的消费量约占60% 、药品消费约占20、化妆品消费约占8%。在美国、欧洲、澳大利亚等地，辅酶Q10的保健食品和减肥食品十分热销，有统计显示，近年来美国市场上辅酶Q10的市场年增长率达到15%20% 。我国辅酶Q10原料药一直依靠日本进口，现在国内需求量约为20多吨。我国对辅酶Q10的市场需求也在增加，预计到2010年，全球年需求量将达500吨，中国的年消费量将达60吨。日本是世界上最早开发辅酶Q10的国家，是辅酶Q10的最大生产国和供应商，日本淘汰了旧生产工艺，改用新工艺生产，多年来，日本辅酶Q10的产量位居世界首位，全球辅酶Q10产量的9O%均来自日本，全世界数十亿美元的市场被其垄断。为了改变目前这种垄断局面，1999年，我国第一条茄尼醇合成法生产辅酶Q10的生产线在江苏海门通联化工有限公司投产，年生产规模达到10吨。此后云南陆良云大通发生物产业有限公司、西安浩天生物技术公司、河南天方药业等公司相继投入对辅酶Q10的生产，此外济南诚汇双达化工、浙江台州开仓化工、浙江新合成制药公司等公司也将在近期投产。众多国内企业纷纷投产辅酶Q10，一时间，我国辅酶Q10产量大增，从而打破了原有的市场格局。4.2 辅酶Q10的市场前景 当前辅酶Q10产品的市场需求日益强劲，在此趋势下，开发出改进型的口服辅酶Q10产品已成为大势所趋。市场规模的逐渐放大正推动辅酶Q10在原料阶段的研发继续升温。开发辅酶Q10原料制剂和提高它们的生物有效性是一项很艰难的工作，许多制药公司正在寻求解决方法。今年4月底，巴斯夫公司推出了两种新等级的辅酶Q10膳食补充剂SoluQ10 5% 和Coenzyme Q1010DC。前者是一种增溶性辅酶7Q10，据说用于软胶囊时具有良好的液态制剂性质；后者是一种起快速作用的稳定粉末，可直接被浓缩进片剂之中。巴斯夫公司表示，生产商在生产传统的原料粉末不必再通过湿法制粒和压缩过程。 其他公司也在进行类似的功能开发。比如德国 Aquanova公司将其纳米技术系统NivaSol应用到了辅酶Q10中，从而使活性物质包含在产品的微囊内。据悉，这可以使辅酶Q10具有更高的生物有效性，使原料药获得脂溶性和水溶性。 从长远看，辅酶Q10是一个市场前景十分广阔的产品，今后还有很大的发展空间。我国企业一定要下决心攻克难关。参