微生物育种学全套讲义.doc

微生物育种学第一章 绪论主要内容： 工业微生物育种在发酵工业中的地位；工业微生物育种的进展；工业微生物育种的方法 第一节 工业微生物育种在发酵工业中的地位现代发酵工业迅猛发展的原因：发酵工艺改进和发酵设备更新；进行菌种的选育及其改良，为发酵工艺提供了人类需要的各种类型的突变菌株 使抗生素、酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、核苷酸、激素、生物碱、不饱和脂肪酸以及其他生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千倍地增长，同时产品的质量也不断提高。工业微生物育种的重要意义:1、提高发酵工业产品的产量和质量2、开发利用微生物资源，增加发酵工业产品的品种工业微生物菌种的筛选理想的工业发酵菌种（是工业微生物技术的关键和基础）必须具有下述特性:1.纯培养物;2.遗传性状稳定;3.生长速度快;4.能利用廉价、来源广、成分简单的培养基；5.忍耐不良环境能力强;6.快速生产目的产物.微生物菌种的获得微生物的自然分布土壤中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源。微生物菌种获得的途径菌种的来源 工业微生物的直接来源向菌种保藏机构索取有关的菌株微生物菌种分离筛选过程（一）微生物样品的采集：1.土壤采样:土壤有机质含量和通气状况;土壤的纵剖面;土壤pH;表面的植被;地理条件;季节条件.2.根据微生物生理特点采样微生物的营养需求和代谢类型与其生长的环境有很大相关性; 具有特殊性质的微生物的筛选; 海洋微生物能够产生不同于陆地来源的特殊代谢物.(二)富集培养概念:控制因素:（三）分离纯化：1.好氧微生物的分离纯化 常规的分离方法平皿反应快速检出法:透明圈法;变色圈法;生长圈法;抑菌圈法2. 厌氧微生物的分离纯化(四)菌种筛选、性能评价及菌种的初步鉴定 第二节 工业微生物育种的进展工业微生物育种，无论从自然变异中选择或是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的基础上。遗传和变异是生物界生命活动的基本属性之一。没有变异，生物界就失去进化的素材；没有遗传，变异也无法积累。同样，对于优良菌株的选育，没有变异，就没有选择的素材；没有遗传，选到的优良性状，也不能进行培育。工业微生物育种学是建立在微生物遗传学基础上，两者相辅相成。微生物本身，在漫长的进化过程中，达到适合于它的生存和繁衍的水平。野生型微生物经自然选择，能适应它的周围环境，能适应同其他物种的竞争，但却不能按人的意志生产人们需要的物质。因此，从人类的利益出发，须对工业微生物菌种进行改良，使之产生数量远远超出微生物本身需要的物质，或者不是它正常产生的新物质。对工业微生物菌种进行有目的的改良，是在有关微生物遗传学知识被人们了解并掌握之后才成为可能的。同时，这种改良涉及多学科领域。 诱变育种技术的诞生与发展 微生物遗传学诞生；诱发突变技术；抗生素和氨基酸等工业发展需要 自然选育 人工诱变选育 如:抗生素生产，特异青霉表层培养只有12U/ml 分离出产黄青霉同时伴以沉没培养成功，达到20U/ml 经过四十多年的诱变育种，到目前已达60 000U/ml以上 （比原始菌株的产量提高了上千倍。）其他抗生素品种如链霉素、土霉素、四环素、红霉素及灰黄霉素等，都由原来的几十单位提高到目前的几万单位。1981年，吴松刚教授从我国土壤中分离出灰黄霉素野生型菌株4541，经耐前体抗性选育，获得D-756变株。短短6年，发酵单位提高60倍以上，跃居世界领先水平。都由原来的几十单位提高到目前的几万单位。又如，代谢控制育种（活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株）以20世纪50年代末谷氨酸发酵取得成功使发酵工业进入第三转折期代谢控制发酵时期，并在其后的年代里得到飞跃的发展。 从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累，并且在有控制的条件下培养，大量地生产这种有用产物重组育种技术的诞生与发展 菌株长期使用诱变剂处理之后除产生诱变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生长周期的延长、代谢减慢等，这对发酵工艺的控制是不利的。杂交育种可以作为育种的另一手段，其成功不仅表现在种内杂交上，而且在种间杂交以至属间杂交都取得令人满意的结果。杂交的目的：把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。从发酵工业微生物育种史，可以看到经典的诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的育种手段，但是它具有一定的盲目性。代谢控制育种的崛起标志着发展到理性阶段，导致了氨基酸、核苷酸及某些次级代谢产物的高产菌株大批地投入生产。代谢控制育种作为工业微生物育种最为活跃的领域而得到广泛的应用，它与控制的杂交育种汇合在一起，反映了当代工业微生物育种的主要趋势。 重组DNA技术的诞生与发展 近年来，基因工程在工业微生物菌种选育中的应用得到迅猛发展。世界上以基因工程方法创造的各种工程菌不计其数基因工程育种 以微生物为出发菌株利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或者是将微生物甲的某些基因导入微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得的新菌种。实现了人为的菌种选育，一切可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，是一种最新的最先进的育种技术。基因工程菌的构建和应用，已在多方面显示出其巨大的生命力。 通过基因工程的方法生产药物已获得包括治疗用的药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等几十种批准上市的品种；通过基因工程的方法提高菌株生产能力已获得包括氨基酸类（苏氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸等）、工业用酶制剂（脂肪酶、纤维素酶、乙酰乳酸脱羧酶及淀粉酶等）以及头孢菌素C的工程菌，都大幅度提高了生产能力；通过基因工程的方法改造传统发酵工艺如氧传递有关的血红蛋白基因克隆到远青链霉菌，降低了对氧的敏感性，在通气不足时，其目的产物放线红菌素产量可提高4倍；通过基因工程的方法提高菌种抗性构建包括活性干酵母和酵母工程菌，抗噬菌体谷氨酸工程菌以及利用工程菌处理工业废料和废水等。以上诸多类型的基因工程菌的构建，使工业微生物育种突破了传统、经典的育种模式，在工业微生物育种中展示了极为光明的前景。微生物遗传育种技术简介一、诱变育种：采用物理和化学等因素对出发菌株进行诱变处理，然后运用合理的筛选程序及适当的筛选方法把符合要求的优良变异菌株筛选出来的一种育种技术。 二、重组育种：利用不同微生物菌株间遗传物质的重组而实现的工业微生物育种技术。 三、重组DNA技术：在体外构建重组DNA分子并导入宿主内表达，从而获得重组工业微生物菌种的育种技术。 思考题一、试述工业微生物育种在发酵工业中的地位。二、试述工业微生物育种学的发展史。三、简述微生物育种技术第二章 微生物细胞的结构与分裂本章内容：微生物的细胞结构与功能；细胞分裂；真核微生物的生活史原核微生物无核膜包围，只有裸露DNA，无有丝分裂，缺少由膜包围的其他细胞器（如线粒体、内质网、叶绿体等）的原始单细胞生物。真核微生物细胞核有核膜包围成一个明确的核，能进行有丝分裂，还具有由膜包围的其他细胞器的生物。细菌细胞结构与功能一般构造：如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体、核糖体等，是所有细菌都有的构造特殊构造：主要有鞭毛、菌毛、性菌毛、糖被和芽孢等，并非所有细菌都有的构造细菌细胞壁cell wall:细胞壁是位于菌体的外层，内侧紧贴细胞膜的一层无色透明，坚韧而有弹性的结构。细胞壁约占细胞干重的10%25%。主要由肽聚糖构成。 细胞壁的功能：细胞壁赋予细胞以硬度和形状，为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需，并能阻拦某些大分子物质进入细胞，保护细胞免受有害物质的损伤，它还决定了细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性等特有的生理功能。细胞壁的基本骨架肽聚糖概念：肽聚糖是由N乙酰胞壁酸（NAM）和N乙酰葡糖胺（NAG）以及短肽链（主要是四肽）组成的亚单位聚合而成的大分子聚合物。肽聚糖单体网状结构NAG 与 NAM 残基以-1,4糖苷键交替连接，形成聚糖的骨架（主链）；一组相同的短肽侧链接于NAM上；相连主链上的短肽侧链通过一条肽桥、或直接相连，从而形成网状分子结构。溶菌酶对细胞壁的作用可切断NAM和NAG之间的b1，4糖苷键，引起细菌裂解。 对G菌，在EDTA存在下，受溶菌酶作用。 溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1 0.2M）蔗糖液中。青霉素对细菌细胞壁的作用Penicillium与转肽酶结合，而使该酶失活，抑制了侧链末端的丙氨酸与五肽桥的连接，破坏了细菌细胞壁的完整性（即抑制肽聚糖的合成），因此， Penicillium仅对正在生长着的细菌，且主要是对G+菌有效。细胞壁缺损型细菌概念：自发突变或人为得到缺壁细菌。 原生质体：人为用溶菌酶除CW或青霉素抑制CW合成得到CM包裹的球状细胞，一般G最易形成原生质体。球状体又称原生质球，指还残留了部分细胞壁（尤其是G-细菌外膜层）的原生质体。共同特点： 对环境条件变化敏感； 即使有鞭毛，也不能运动； 对噬菌体不敏感； 外源基因容易导入，有利于遗传学基本研究； 不同菌种或菌株的原生质体间易发生细胞融合，因而可用于杂交育种。酵母菌细胞的构造酵母菌的细胞结构与其他真核生物基本相同，右图是电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示意图。酵母细胞的细胞壁(1)细胞壁结构：酵母细胞壁呈“三明治”结构细胞壁外层：甘露聚糖（约占40%-45%，以-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）)内层：葡聚糖（约占30-40%，由D-葡萄糖以-糖苷键联结）中间层：蛋白质（含5-10%，多为酶类） （2）壁外成分： 有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。 包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。 （3）细胞壁的少量组分脂类(3%-8%)和几丁质（1%-2%)和灰分.蜗牛酶 ：水解酵母菌细胞壁制备原生质体或水解酵母子囊壁以释放单倍体子囊孢子。 霉菌的构造由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体、内质网及各种内含物（肝糖、脂肪滴、异染粒等）等组成。幼龄菌往往液泡小而少，老龄菌具有较大的液泡。霉菌细胞壁：除少数低等水生霉菌细胞壁含纤维素外,大部分霉菌细胞壁主要由几丁质组成. 霉菌的细胞壁可用蜗牛消化酶等消化霉菌的细胞壁，制备霉菌的原生质体。 核质体(nuclear body;nucleoid)又叫核区、拟核、类核等，由大型环状双链DNA纤丝不规则地折叠或缠绕而构成的无核膜、核仁的区域细菌DNA：长度：一般为：0.253mm例：大肠杆菌的DNA长约1mm。生长迅速的细菌在核分裂之后细胞往往来不及分裂,所以细胞中常有24个核质体，而生长缓慢的细菌细胞中一般只有12个核区，不在染色体复制时期一般是单倍体。功能：负载遗传信息。 质粒(plasmids)细菌染色体外的共价闭合环状双链的小型DNA分子分子量约为100 106 D. 一个菌细胞可有一或多个质粒,每个质粒上有几十个基因 。质粒的特点：1、可以在细胞质中独立于染色体之外（即以游离状态）存在，也可以插入到染色体上以附加体的形式存在；2、在细胞分裂时，可以不依赖于细菌染色体而独立进行自我复制，也可以插入到细菌染色体中与染色体一道进行复制；3、质粒可以通过转化或接合作用而由一个细胞转移到另一个细胞，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；4、质粒对于细胞生存并不是必要的。质粒已作为基因工程中的克隆载体质粒的种类:1、大肠杆菌的F因子2、细菌抗药质粒（R因子）3、大肠杆菌素质粒（Col因子）4、降解质粒5、Ti质粒第二节 细胞分裂任何生物细胞的生命都是有一定限度的，要延续细胞生命必须进行细胞分裂，细胞分裂是实现生物体生长、繁殖以及世代之间物质与机能连续性的一种必要方式。细胞分裂:无丝分裂、有丝分裂、减数分裂一、细胞的有丝分裂有丝分裂是细胞分裂的主要形式。多细胞生物体的细胞由有丝分裂而增多，即有丝分裂是生物体的体细胞分裂，分裂结果使生物体变粗、变长、变大。有丝分裂使细胞核和细胞质各分成两半。细胞核的分裂在染色体开始分裂前已经复制成一倍。染色体数目的正确分裂是有丝分裂的关键，而细胞质的分裂不一定十分正确。有丝分裂的过程按如下几个时期进行：间期、前期、中期、后期、末期二、细胞的减数分裂减数分裂是生物个体数增加，它是有丝分裂的一种特殊形式。这种分裂是二倍细胞变成单倍细胞或生殖细胞成熟时的一种分裂方式，它要进行连续二次的分裂。在二次分裂中，染色体仅分裂一次，而细胞则分裂二次，结果产生4个子细胞，使每个子细胞的染色体数目减少一半。对高等生物来讲，生殖细胞的前身是二倍的卵母和精母细胞。要形成单倍的精子和卵子必须经过减数分裂方能进行结合、遗传而成二倍的体细胞，否则倍数会不断增加，生物就无法维持其遗传稳定性。对低等生物，如衣藻、真菌等有性世代的有性生殖过程中的合子是二倍体，而它们的孢子和营养体（植株、菌丝体）是单倍的。由于这些生物有性世代的二倍体阶段是很短的，也必须进行减数分裂回到单倍体世代。减数分裂的过程：第一次分裂，染色体和细胞都分裂。第二次分裂，染色体不分裂仅细胞分裂。减数分裂的意义：各种生物由于减数分裂和两性细胞结合（受精作用）过程的交替进行，使染色体数目和遗传性状有规律地保持相对稳定；在减数分裂过程中，通过同源非姐妹染色体单体之间的交换和重组，引起变异的发生，这为杂交育种提供了理论和实践基础，在生物界的遗传和进化上具有重要意义。第三节 真核微生物的生活史生活史：生物在生长发育一个循环周期中的一系列变化。例如，丝状真菌从一种孢子开始，经过一定的生长繁殖，包括无性繁殖和有性繁殖两个阶段，最后有产生同一种孢子，这一循环称为丝状真菌的生活史。高等动植物只有有性生殖，从性细胞受精后，经过生长发育，直至生命结束。低等生物（包括真核微生物）繁殖后代，通过有性生殖、无性生殖或准性生殖来完成的。生物在整个生活周期中可以从形态、细胞功能和染色体倍数变化的几个方面来完成它们的生长发育过程，但不同生物其生活史在以下几方面的表现是不同的。多细胞的高等动植物是二倍体生物，它们的体细胞为二倍体，通过减数分裂产生两性生殖细胞，即精、卵细胞。两性细胞相互融合，形成二倍体的受精卵，经过有丝分裂产生许多二倍体的体细胞。真核微生物，多数属于单倍体生物。它们的体细胞是单倍的，用来接合的两个体细胞不需要进行减数分裂就可以成为接合子。它们是二倍体的体细胞，经过减数分裂产生单倍体的有性孢子，有性孢子萌发后产生单倍的营养体。酵母菌有两个类型生活史较为特别。营养体既可以单倍体也可以双倍体形式存在，酿酒酵母是这类生活史的代表。营养体只能以二倍体形式存在，路德类酵母是这类型的代表。真菌的生活周期包括无性繁殖、有性繁殖或准性繁殖。有性繁殖往往比无性繁殖少得多，只在特定条件下才出现。不产生有性孢子的半知菌纲中的真菌，往往以准性繁殖来完成它们的生活史。有的真菌本身能产生有性孢子，但也有可能进行准性繁殖。霉菌的生殖 霉菌的基因重组一般也可以通过有性生殖或准性生殖过程完成准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单倍体化 霉菌的有性生殖有性孢子繁殖两个性细胞结合产生新个体的过程a）质配：两个性细胞结合，细胞质融合，成为双核细胞，每个核均含单倍染色体（n+n）。b）核配：两个核融合，成为二倍体接合子核，此时核的染色体数是二倍（2n）。 c）减数分裂：具有双倍体的细胞核经过减数分裂，核中的染色体数目又恢复到单倍体状态。霉菌的准性生殖 图准性生殖与有性生殖的比较 体第三章 遗传的物质基础本章内容：染色体；核酸；基因的组织与结构遗传物质 生物性状遗传物质的本质的揭示：孟德尔（Mendel,G.J.）18561864年进行豌豆杂交试验，发现分离和独立分配遗传规律只是一种逻辑推理产物 没有任何物质内容认为生物性状是受细胞里的颗粒性遗传因子控制约翰生（Johannsen,W.L.）1909年用“基因”（gene）一词代替孟德尔的遗传因子概念但是，没有给出“基因”物质内容。贝特生（Batson,W.）和摩尔根（Morgan,T.H.）19001910年在香豌豆、果蝇的遗传研究中发现性状连锁现象（linkage）。摩尔根提出了连锁遗传规律结合染色体动态研究结果限于当时科学水平，不能对基因赋予实体内容，但已预见了基因将是一个化学实体。基因位于染色体上，基因是染色体的一段片段阿委瑞（Avery,O.T.）证明DNA是遗传物质。Griffith实验1928 S活菌，致死小白鼠 S死菌，不致死小白鼠 R活菌，不致死小白鼠 R活菌+S死菌，致死小白鼠， 分离出S活菌体内转化实验DNA是遗传物质的证明1928年，英国微生物学家Griffith.F做了肺炎双球菌的转化实验 沃森（Watson,J.D.）和克里克（Crick,F.H.C.）20世纪50年代提出DNA双螺旋结构模型，明确了DNA是遗传信息的载体，是遗传物质，基因是DNA分子上的一个片段。除了DNA外，有些动物、植物病毒和噬菌体是以RNA作为遗传物质。遗传物质主要分布在真核生物的细胞核、原核生物的核质体中。细胞质中的某些细胞器，如叶绿体、线粒体、质粒等也含有遗传物质。随着物理、化学、分子生物学等先进技术和设备的应用，对遗传物质基本单位基因的本质、组织结构等的认识越来越深入，也赋予基因新的内容，形成基因组学这门学科。第一节 染 色 体所有细胞型生物都具有携带基因的结构，这种结构染色体（chromosome）。原核生物与真核生物之间存在差别：原核生物的染色体由环状双链和极少的蛋白质构成，细胞中仅有单个染色体，每个染色体有单一的DNA复制起始位点，染色体包含在核质体中。真核生物有若干条线性染色体，DNA与大量的蛋白质紧密结合，每一真核生物具有多个DNA复制起始位点。染色体包含在细胞核中。一、染色体形态根据着丝粒的位置可以把染色体分为四种典型的形态，它们分别是：中着丝粒染色体、中着丝粒染色体、着丝粒染色体、端着丝粒染色体所有真核生物的染色体具有着丝粒和端粒这两个重要区域。着丝粒在细胞分裂过程中，作为纺锤丝的附着点，缺乏着丝粒，细胞将无法进行正常的分裂。端粒不仅是染色体末端的一个区域，它还具有特殊的结构。在端粒区域，含有DNA重复序列，如人类该序列为TTAGGG。在生殖细胞中，每个端粒含有大量的重复序列（repeat sequence），但是，随着体细胞衰老，端粒中的重复序列数量逐渐减少。维持端粒长度的恒定要靠端粒酶。研究发现在体细胞中，缺少端粒酶，但在肿瘤细胞中重新出现了端粒酶。二、原核生物及病毒染色体结构以大肠杆菌为例来阐明原核生物染色体结构特点。大肠杆菌染色体以单个双链环状DNA分子构成，大约有4.6106bp。这种染色体组成了大肠杆菌的拟核（核质体）。在拟核中DNA占80%，其余为RNA和蛋白质。DNA与蛋白质相互作用形成“脚手架”形结构（见图）。在这种结构中，DNA链形成了大约50100个功能域或环。每个环大约有50100Kb。当用微量的DNA酶处理，会使少量DNA环成为松弛状态，而其他环保持超螺旋状态不变。病毒没有典型的染色体结构。习惯上把病毒含的RNA或DNA也称为染色体。对DNA 病毒来说，不同的病毒其DNA形态结构多种多样，如ssDNA或dsDNA；环状或线状。对RNA病毒来说，RNA为线状，ssRNA或dsRNA。甚至含有多条RNA链。三、真核生物染色体结构真核生物染色体由高度有序的DNA蛋白质复合体（核蛋白）构成，这种复合体称染色质。染色质中超过50%的成分为蛋白质，在细胞周期的不同阶段，由于染色质组织结构的变化而导致不同的染色体结构状态。化学组成：1/3 DNA，1/3 Histones（组蛋白） 1/3Nonhistons （非组蛋白）及少量 RNA和磷脂。 DNA： 携带传递遗传信息，染色体的功能体现者。组蛋白：染色体中与DNA联结的碱性蛋白质，是染色体主要的结构蛋白。近乎所有的染色体中都含有5种组蛋白，除H1外，无种或组织特异性。非组蛋白：染色体中除组蛋白外的其他蛋白，其种类比组蛋白复杂得多，具种和组织特异性。 小牛胸腺染色体组蛋白的特点染色体的结构分子生物学和生物化学研究表明，染色体基本结构单位为核小体，核小体连接成染色质丝，经卷曲形成螺线管solenoid，（中期）后者进一步卷曲成超粗纤维，再进一步浓缩即为染色体。高度浓缩的染色体长度只有DNA双螺旋的1/万左右。四、染色体数目真核生物多数为二倍体（diploid）生物，原核生物大多为单倍体（haploid）生物。减数分裂中染色体行为发生差错，常常引起染色体数目的变化。整倍体个体中的染色体数为基数的整倍数，如一倍体、二倍体、三倍体等类型。非整倍体 体细胞核中具有非整倍数染色体单体（二倍减一，monosomic diploid): 2n-1缺体（二倍减二，nullisomic dilpoid): 2n-2三体（二倍加一，trisomic diploid): 2n+1 四体（二倍加二，tetrasomic diploid): 2n+2双二倍加一（double trisomic）: 2n+1+ 1部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍第二节 核 酸脱氧核糖核酸（DNA）是细胞中最重要的分子，它含有生物全部遗传信息，核糖核酸（RNA）可以作为某些病毒的遗传物质。一、核酸DNA和 RNA中的碱基是杂环芳香环。腺嘌呤、鸟嘌呤为双环结构，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶为单环结构。二、RNA所有生物的细胞内都含有三种RNA ，即mRNA、 tRNA和rRNA。原核生物中有三种rRNA ，真核生物有四种rRNA。是核糖体（ribosome）的重要成分。（见图表）生物体内存在着与20种氨基酸对应的tRNA分子，它们在蛋白质合成过程中，起着接受、转运和掺入氨基酸的作用。mRNA的功能是从DNA上把遗传信息接受过来，决定蛋白质的氨基酸顺序。三、DNA第三节 基因的组织与结构一、基因组基因组对于原核生物来说，就是他的整个染色体。对于二倍体的真核生物来说，是能够维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体。二、基因三、遗传密码第三章 思考题遗传物质的化学本质是什么？简述其证明实验。 简述遗传物质在各种微生物中的存在状态及复制方式。第四章 基因突变本章内容：突变的概念；突变类型；突变体形成突变（Mutation）：突变泛指细胞内（或病毒颗粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，突变是一种遗传状态，往往导致产生新的基因及新的表现型。 突变体：带有突变基因的细胞或个体 突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。 第一节 突变类型一、按突变发生原因分类 自发突变(spontaneous mutagenesis) ：未经任何人为的处理而自然地发生的突变，称为自发突变。 诱发突变(induced mutagenesis) ：由人们有意识地利用物理或化学手段引起的突变称为诱发突变。 诱发突变的频率要远远高于自发突变频率 二、按变化范围分突变类型突变的分子机制突变可以发生在染色体水平或基因水平，发生在染色体水平的突变称为染色体畸变（chromosomal aberrztion）；发生在基因水平的突变称为基因突变(gene mutation)。 染色体畸变（chromosome aberration)染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。 染色体数目的变化 整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组 单倍体（ n ）：haploid 二倍体（2n）：diploid 三倍体（3n）：triploid 四倍体（4n）：tetraploid非整倍体 aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。 单体（二倍减一，monosomic diploid): 2n-1 缺体（二倍减二，nullisomic dilpoid): 2n-2 三体（二倍加一，trisomic diploid): 2n+1 四体（二倍加二，tetrasomic diploid): 2n+2 双二倍加一（double trisomic）: 2n+1+ 1 部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍染色体结构的变化 染色体结构的改变，多数是染色体或染色单体遭到巨大损伤产生断裂，而断裂的数目、位置、断裂端连接方式等造成不同的突变 包括染色体缺失、重复、倒位和易位等 涉及到DNA分子上较大范围的变化，往往会涉及到多个基因。 染色体结构的变化 缺失 deficiency ：是染色体片段的丢失。 重复 repetition ：是染色体片段的二次出现。倒位 inversion：是指染色体的片段发生了180的位置颠倒 易位 translocation ：是指一个染色体的一个片段连接到另一个非同源染色体上。 相互易位 reciprocal translocation：两个非同源染色体间相互交换一部分。基因突变（gene mutation）基因突变：是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对核苷酸的缺失、插入或置换，分为碱基置换和移码突变。 染色体局部座位内的变化 点突变point mutation ：单碱基对的置换 突变发生在一个基因范围内。 多位点突变：突变超出一个基因范围。 碱基置换 base pair substitution DNA链上一个碱基对为另一碱基对所取代叫碱基置换 转换 transition ：DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被另一个嘌呤（嘧啶）所置换。 颠换 transversion：DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被一个嘧啶（嘌呤）所置换。移码突变 frameshift mutation在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和转译错误的突变叫移码突变。 一般只引起一个基因的表达出现错误。 三、按突变是否引起遗传编码特性的改变分类 一类是引起遗传性状改变 ： 错义突变（missense mutation），无义突变（nonsense mutation）和移码突变 一类是不改变遗传性状的突变 同义突变（synonymy mutation）和沉默突变（silent mutation）。 遗传学效应 错义突变 missense mutation：突变后的密码子编码另一种氨基酸。个别碱基的改变导致多肽链上某个氨基酸为另一种氨基酸所取代。 例：GAT突变为CAT，编码的氨基酸由亮氨酸变成缬氨酸。 无义突变 nonsense mutation：突变后的密码子变为终止密码。 例：ACC突变为ATC,编码的氨基酸由色氨酸变为终止密码子同义/沉默突变 silent mutation：突变后的密码子编码的仍是同一种氨基酸。（碱基序列发生改变而氨基酸序列未发生改变的突变称为同义/沉默突变）。 例：TAA突变为ATG，两者都编码异亮氨酸。 同义突变的发生是由于遗传密码的简并性。 同义突变和沉默突变不会导致编码特性的改变，但往往会引起限制酶切割位点的变化，造成DNA限制片段长度的多态性。 四、按突变的表型变化效应分类野生型 wild type：表现该物种正常表型的生物。 突变型 mutant：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。形态突变型morphological mutant ：引起细胞个体形态和菌落形态发生改变的突变型。是一种可见突变。包括细菌鞭毛、芽孢、荚膜的有无，霉菌或放线菌的孢子的有无或颜色变化，菌落的大小，菌落表面的光滑、粗糙，以及噬菌体的大小或清晰度等的突变。 生化突变型：不管是形态突变、营养突变、条件致死突变或致死突变，都是以生物化学为基础，是相应酶的结构活性改变，引起生化代谢的变化，所以突变型都可以认为是生化突变。 其中最典型的是营养缺陷型（auxotrophic mutant）：它从野生型基因突变形成。其特点是由于突变而失去合成某种代谢物质的能力，如氨基酸、维生素等。归入生化突变型的还有糖类分解发酵突变株，色素形成突变株及有益代谢产物生产能力突变株。条件致死突变型 conditional lethal mutation：是一类遗传学分析最有用的突变性，它们的生命分界线由某种条件决定。这种突变体在允许条件下存活，在限制条件下致死。 其中应用得最广的是温度敏感突变型。致死突变型 lethal mutant： 由于基因突变造成个体死亡的突变型。 杂合状态的显性致死和纯合状态的隐性致死都导致个体的死亡抗性突变型 resistant mutant： 是最为常见的一种突变，它包括抗药突变、抗噬菌体突变、抗高温突变及抗辐射突变等。 使相当数量的细菌群体生活在含有一定浓度的抗性因子环境中，其中敏感菌将大量死亡，仅有极少量的细菌能够存活并且继续生长繁殖，这就是抗性突变体。这种突变株的产生，究竟是因为细菌和抗性因子之间长期接触得到“驯化”，还是因为细菌本来就具有这种抗性突变基因呢？在1943年之前，一直是人们争论未决的问题。次后一些科学家完成了这方面的研究，如抗噬菌体的波动试验和涂布试验，抗链霉素的影印试验等。这些实验所得出的信服可靠的结论终于解答了这个问题。1）波动实验 2）涂布实验 3）影印培养实验 波动实验fluctuation test 涂布实验影印培养replica plating实验第二节 突变体的形成基因突变是微生物育种的基础。基因突变的结果会影响或改变微生物某一形态或生化性状。通过细胞繁殖、分裂，这种突变形成的性状会遗传给后代，发育成为新的遗传型个体。 基因突变遵循以下的一般规律，即突变具有自发性、稀有性、随机性、独立性、可诱发性、可遗传性、可逆性。 某些化学、物理因素能诱发基因突变，并且通过进一步处理又可引起突变基因回复。突变是可逆转的，突变的发生并不一定意味着突变体的产生及性状的改变。突变到突变体的 形成是经历一个复杂的生物学过程。因此，直到今天，人们还不能完全定向控制诱发突变后获得的突变个体的性状。突变生成过程 图一、突变体的形成过程（一）诱变剂接触DNA分子之前细胞的透性影响诱变剂的诱变效应 当化学诱变剂处理微生物细胞时，首先和细胞充分接触，通过扩散作用诱变物质穿过细胞壁、膜及细胞质，才能达到核质体，与DNA接触。前诱变剂在细胞质的作用下会转化成诱变剂 诱变剂透过细胞壁后还要穿过细胞质，这个过程诱变剂也会发生一些化学变化，受到各种因素的影响，如亚硝酸和蛋白质或游离氨基酸起反应，使它们氧化脱去氨基，以此影响诱变效应。（二）突变发生过程诱变剂和DNA接触后能否发生基因突变，与DNA是否处在复制状态有密切关系。而DNA复制活跃程度与某些营养条件和细胞生理状态有关。 如，一个氨基酸营养缺陷型的大肠杆菌菌株，如果在培养基中除去它需要补给的氨基酸，培养12h，用亚硝基胍进行诱发回复突变，其诱变效应显著下降。反之，如补给所缺的氨基酸，则频率提高。诱发效应上升的先后次序是精氨酸、丝氨酸、脯氨酸。这些顺序与各个基因在DNA上的排列次序是相吻合的。这被解释为DNA在染色体上的复制由某一位点开始逐步向前，亚硝基胍最有效的诱变作用正好发生在复制的那个位置。 又如，大肠杆菌的-半乳糖苷酶结构基因Z的诱发效应，与培养基中加诱导物和不加诱导物有关。加诱导物以后，用亚硝基胍、硫酸二乙酯和甲基硫酸乙酯等诱变剂处理，它们的诱变效应比不加诱导物的高68倍。认为这一现象可能由于DNA转录时双链解开，使以上诱变剂的诱变效果处于最为有利的状态。 但如果用X射线、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤等诱变剂来进行处理时，则是否加诱导物对诱变效果没有什么影响，这表明不同性质的诱变剂和DNA双链的构形对突变都会有影响。从诱变剂进入细胞，到突变发生，会受到多种酶的作用和影响。很多实验证明，在酶的作用下，有的诱变剂诱变作用加强了，有的却减弱了，有的甚至完全变成另一种物质。显而易见，在诱变剂进入细胞后，那些对酶的活性和作用有影响的物质及培养条件都将间接地影响诱变剂的诱变效应。（三）突变体的形成 诱变剂和DNA接触后发生化学反应，继而使DNA上的碱基发生变化，产生突变。但是从突变到突变体的形成要经过相当复杂的过程，并且不是所有的突变都能形成突变体。当一个突变发生后，要经过复制，才能成为突变体。在复制前后过程中，生物细胞有一整套修复系统进行修补，还有某些校正机能的作用以及细胞中一系列酶的反应，都有可能使突变了的DNA结构复原，以保证遗传物质的相对稳定和生物自身准确地繁殖后代。二、突变的修复DNA分子要求保持高度的精确性和完整性 保障DNA安全的修复系统 纠正偶然的复制错误：如：DNA多聚酶35的校读功能、糖基酶修复系统等DNA分子损伤的系统 ：如光复活修复系统、切除修复系统、重组修复系统、SOS修复系统 （一）复制错误修复1DNA多聚酶的校读功能2N-糖基酶修复系统 N-糖基酶（N-glycosylases） 作用：专一识别 DNA分子中的非标准碱基和碱基的衍生物。 例：尿嘧啶-N-糖基酶系统修复机制 参与的酶 尿嘧啶N-糖基酶、AP限制性内切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶Pol I、DNA连接酶。 尿嘧啶-N-糖基酶系统的修复过程3.错配修复（mismatch repair）识别错配的碱基对； 对错配的一对碱基要能准确区别哪一个是错的，哪一个是对的； 切除错误的碱基，并进行修复合成。 （二）损伤修复 （T=T）1光复活（photoreactivation）（又称光修复） 光复活作用：指细菌在紫外线照射后立即用可见光照射，可以显著地增加细菌的存活率，降低突变率。 光修复机制只作用于紫外线照射所形成的损伤 修复机制：光复活酶（photo-reactivating enzyme，PR酶），催化嘧啶二聚体分解成为单体 2切除修复(excision repair) 暗修复（ Uvr修复系统 ） 是细胞的主要修复系统，发生在DNA复制之前，是对模板的修复。 一种多步骤的酶反应过程：限制性内切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的协同作用 结果：使损伤的DNA分子恢复正常 修复过程： 切 补 切 封限制性内切酶 E. coli的修复内切酶由三种亚基构成：UvrA、UvrB、UvrC； 限制性内切酶UvrABC能修复不同类型的损伤； 它识别的是DNA某一部位缺少正常的形状如：胸腺嘧啶二聚体引起DNA双螺旋的变形。 Uvr系统负责切除大量的胸腺嘧啶二聚体 3重组修复recombination repair（Rec修复系统） 是一种越过损伤而进行的修复 不将损伤碱基除去，而是通过复制后，经染色体交换，使子链上的空隙部位不再正对T=T，而是面对正常的单链。 留在模板链上的二聚体：切除修复加以除去，或经细胞分裂而稀释4.SOS修复系统Jeam Weigle 等发现 UV 感染 细菌(用UV照射过) 存活率高 噬菌体 细菌(UV未照射过) 存活率低 UV-复活（UV-reactivation），也称W-复活 SOS反应（SOS response）有关SOS修复的机制，有人提出了图中所示的模式，受到损伤的DNA发出信号，使recA基因的产物活化，而使SOS修复酶的阻遏物不活化（蛋白酶分解作用），结果使SOS修复酶诱导并对DNA损伤进行修复。 图三、突变基因的形成 1. 前突变的不同命运 损伤太大，细胞死亡； 损伤较小，细胞存活 DNA损伤未修复，细胞DNA经复制变成突变型； DNA损伤被修复，回复正常，突变不发生； DNA损伤进行倾向差错修复，发生突变2. 环境因素的影响 环境条件影响DNA修复系统的酶活性 如：咖啡碱抑制切除修复系统的酶；可见光可以激活光复活系统；SOS修复系统属于倾向差错修复，它依赖蛋白质合成，因此丰富的培养基可以强化诱变作用，而氯霉素则相反 有些物质可以增强或减弱诱变剂的活性 助变剂（comutagen）：本身没有诱变作用但对诱变剂的诱变作用具有增强效应的物质； 抗变剂（antimutagen）：能够减弱诱变剂诱变效应的物质四、从突变到突变表型 表型延迟（phenotype lag） ： 指突变体表型的改变落后于其基因型改变的现象。 分离性表型延迟（segregational lag ）：突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延。 生理性表型延迟（physiological lag）：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延。 表型迟延的消除：诱变后进行后培养 第五章 工业微生物育种诱变剂本章内容：化学诱变剂；物理诱变剂；生物诱变剂诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。诱发突变(induced mutation)的发现 1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变异，其效应与X射线相类似。陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技术基因诱变在菌种选育中得以应用， 使生物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。诱变剂mutagen ：凡是能诱发生物基因突变，且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质 。 诱变剂种类：化学诱变剂、物理诱变剂和生物诱变剂 第一节 化学诱变剂定义：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质。 化学诱变剂种类：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变剂。 一、碱基类似物 base analogue 碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。 主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU） /T 2-氨基嘌呤（2-AP） /A 诱发的突变：AT GC的转换。 碱基类似物是如何提高突变频率的? 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进DNA分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的概率也高（一）碱基类似物的诱变机制现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取代，就构成了5-BU的结构式。 诱发的突变 5-BU掺入错误: G CA=T5-BU掺入后的复制错误：A: T G C 由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。 细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5-BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。2-氨基嘌呤（2-AP） 比较容易诱发ATGC这一转换 （二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下：1.单独处理新鲜斜面的细菌转接到前培养的液体培养基中培养到对数期离心除去培养液加入生理盐水或缓冲液饥饿培养810小时加入5-BU到培养液中，使最后的处理浓度为2540g/ml,混合均匀取0.10.2ml菌悬液加入到琼脂平板上涂布培养在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理培养后挑取单菌落，进行筛选。真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.11mg/ml），加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般612h)分离于平皿适温培养挑取单菌落，进行筛选。2.与辐射线复合处理据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。二、化学修饰碱基的诱变剂改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂、烷化剂 常见的碱基修饰剂（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍 1脱氨剂亚硝酸（nitrous acid）是典型的脱氨剂 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变