番茄早疫病对几种种农药的抗药性研究.doc

番茄早疫病对3种农药的抗药性研究番茄早疫病菌是番茄重要病害之一。近年来，由于一些地区推广抗病毒病而不抗早疫病的番茄品种，导致早疫病严重发生。发病时可引起落叶、落果和断枝，对产量影响很大，常年减产20一30，严重时可达50以上，甚至绝产。由于番茄早疫病具有潜育期短、再侵染频繁、流行速率高的特点H1，长期使用单一药剂防治，在药剂的选择压力下病原菌容易形成抗药性群体。目前国内针对番茄早疫病抗药性的研究刚刚开展，这次试验主要测定其对嘧菌酯、腐霉利及代森锰锌3种化学杀菌剂的敏感性，为其推广和科学使用提供了理论依据。 1 材料与方法1.1 菌种的采集番茄早疫病菌采自于临安的农田及学校的农场基地里德番茄早疫病株果实或叶片上，按随机取样的原则进行。取样后将所得的各组织分别装入小袋隔离，带回后对其进行分离纯化。菌株以“采集地点的大写拼音开头+序号”命名。1.2 供试药剂 95嘧菌酯原药，由浙江东风化工有限责任公司提供；978腐霉利原药，由南京仁信化工有限公司提供；8162代森锰锌原药，由浙江东风化工提供。1.3 菌种的分离与纯化131孢子分离法用经过灭菌的接种刀刮取发病叶背表面霉层，接入PDA(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20g，水l 000 m1)平板培养基表面，25下培养，待长出菌丝后，用灭菌的接种针挑取早疫菌丝转入另外一个PDA平板培养基上纯化菌种。132组织分离法将采集到的病叶组织切成35 mill的方形小块，在75乙醇溶液里浸23 s，然后浸在15的次氯酸中漂洗3 min，最后用无菌水洗涤34次。经表面消毒的病组织放置在PDA平板培养基，在25左右恒温箱内保存，直到产生孢子或菌丝为止(约45 d)，用灭菌的接种针挑取孢子或菌丝，移到新的PDA平板培养基上。133单孢分离法将番茄早疫病菌在PDA培养基七培养一周后，注入4的无菌水，刮取气生菌丝，紫外线照射2min，于20一22下干燥6 h后皿内即可产生大量的分生孢子。在培养一周的菌落上用打孔器打下5个菌碟j放在PDA平板培养基上，用涂抹器涂布均匀。25培养24 h后对已萌发的单个孢子进行标记，48 h后再把标记的单个菌落移入斜面培养基。14病原菌的确定病原菌的鉴定利用赫柯氏法则，将分离出的菌株再接回到番茄叶片上，验证是否为病原菌。从菜园中采集健康的番茄叶片带回室内，用无菌水冲洗，然后在无菌的条件下用75的酒精浸泡2 min并用无菌水换洗5次，最后放到带滤纸的灭菌培养皿中。用棉球包裹叶柄的基部并从各分离菌株菌落的边缘用接种针挑取直径4 mln的圆形菌落接到叶背面的两侧，每菌株接3个菌块，置于25培养。3 d后记载发病情况并观察病斑子实体形态。15含药培养基的制备将95嘧菌酯原药溶于甲醇溶液中，配成10 000斗srnl：母液，代森锰锌和腐霉利溶于丙酮溶液中，分别配成10 000 tl，sml和5 000斗sml的母液，都以02的量加入乳化剂Tween80。母液于冰箱4贮藏备用，使用时以无菌水稀释至适当浓度，以10的药液量加入熔化的PDA培养基中(冷却至4550 oC)充分摇匀，制成含最终所需药量的PDA平板，用以进行敏感性测定及其他试验。16敏感基线的建立及敏感性的测定 由于没有采集到番茄早疫病菌的野生菌株，也未见该病菌对杀菌剂敏感基线的报道。浙江省偏远山区建德里中垅从未用过任何杀菌剂，该研究将该地采集分离的菌株所测得的EC50值作为相对敏感基线。由于各杀菌剂杀菌作用方式的区别，对嘧菌酯敏感性测定采用孢子萌发抑制法，对腐霉利及代森锰锌的敏感性采用FAO推荐的菌落直径法一-。从预培养的番茄早疫病菌同一圆周的菌落上制取边缘菌碟置于PDA培养基上，25培养10 d。用无菌水将培养好的孢子从培养基上洗下，4层纱布过滤，滤液即为孢子悬浮液。浓度调至5105个ml。在超净工作台上，将嘧菌酯母液与PDA培养基配制成含0625、0125、0025、0005、000l和0ugml系列浓度的含药平板，将制好的孢子悬浮液均匀涂布于PDA培养基上，以9 ml PDA培养基加1 ml无菌水为对照，重复3次。放入25恒温培养箱中，暗箱培养。48 h后观察孢子萌发数(取3次重复的平均值)。以药剂浓度负对数和抑制率机率值计算毒力回归方程Y=a+bX，根据方程计算有效抑制中浓度(EC50)和相关系数。将被测菌株在PDA平板上培养72 h后，自菌落边缘打取直径为4 mm的菌碟，在含药平板上进行敏感性测定，设置58个梯度浓度，以不加药者为对照，每处理重复3次。各浓度设置如下：腐霉利浓度为0、01、05、10、20、50、60、80、100 ugml，代森锰锌浓度为0、l、5、10、20、50、100、200 ugml。于25培养72 h后，采用十字交叉法测定菌落净生长量，然后分别计算出各浓度对菌丝生长的抑制率。用统计软件DPS处理，求出EC50值(抑制中浓度)。同时可得出最低抑制浓度MIC和亚致死剂量。以敏感基线为标准，测定番茄早疫病菌对3种杀菌剂的敏感性并计算待测菌株的抗性系数，抗性系数小于5则为敏感菌株，大于5则为抗性菌株。相关公式如下：孢子萌发抑制率(%) = 100菌落净生长量=菌落直径一菌碟直径抗性系数=待测菌株EC50值相对敏感菌株EC50值17 抗性频率测定对3种药剂抗性频率的测定以最低抑制浓度(MIC)为标准。将待测菌株孢子悬浮液在含嘧菌酯10 ugml PDA上萌发，将待测菌株菌块在含腐霉利80ugml、代森锰锌200ugml PDA上培养，能萌发和生长的菌株则为对应药剂的抗性菌株。1. 8 抗性菌株抗性水平测定将检测到的抗性菌株分别接种在含系列浓度的含药平板上，测定不同分离菌株对这3种杀菌剂的敏感性，具体测定方法同敏感基线的测定。计算各抗性菌株的EC，并与敏感基线进行比较，统计抗性菌株的抗性水平。抗性倍数计算式为：抗性倍数 = 抗性菌株EC50敏感菌株EC50其中，抗性倍数小于5，归属于敏感类型(S)；520为低抗类型(RL)；20100为中抗类型(RM)；大于100属于高抗类型(RH)。 2 结果与分析2. 1 菌株的分离与病原物确定 从浙江省4个调查地区共采集分离大概100株番茄早疫病菌菌株，分别从里中垅地区、临安周围地区、农林大学官塘、余杭地区采集。采用分离纯化100株菌株确定是否可以使番茄叶片发病。叶片被害症状，初呈深褐色或黑色圆形至椭圆形的小斑点，逐渐扩大，达12 cm，边缘深褐色或黑色圆形至椭圆形的小斑点，逐渐扩大，达12 cm，边缘深褐色，中央灰褐色，有同心轮纹，边缘有黄色晕环。显微镜观察发病叶片上子实体的形态。分生孢子梗单生或簇生，圆筒形，有l一7个隔膜，暗褐色，大小40一90um68 um。分生孢子长棍棒状，顶端有细长的嘴胞，黄褐色，具纵横隔膜。所有这些特征与番茄链格孢的特征一致。再由该试验的无伤接种，认定能引起发病的菌株即为番茄早疫病的病原菌。2. 2敏感基线测定从表1中的数据可以计算得到所选带白哦菌株对腐霉利、代森锰锌及嘧菌酯的平均EC50值。并以此作为番茄早疫病对四种杀菌剂的相对敏感基线。 表1 里中垅地区早疫病对腐霉利及代森锰锌敏感基线 菌株 独立回归方程Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均EC50 MIC 腐霉利 L2 L6 L27 L28 L29 L35 代森锰锌 L2 L6 L27 L28 L29 L35 嘧菌酯 L2 L6 LZ27 L28 L29 L352. 3敏感性测定结果临安、农林大学官塘、余杭三地番茄早疫病菌株对3种常用杀菌剂腐霉利、代森锰锌及嘧菌酯的敏感性测定结果用表24。.并从各表中可以初步计算得到番茄早疫病最三种药 剂的抗性水平。 表2 番茄早疫病对腐霉利的敏感性测定 菌株 独立回归方程Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均EC50 MIC LA22 LA20 LA09 LA21 G 18 G 10 G06 YH20 YH09 YH21 表3 番茄早疫病对代森锰锌的敏感性测定 菌株 独立回归方程Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均EC50 MIC LA22 LA20 LA09 LA21 G 18 G 10 G06 YH20 YH09 YH21 表4 番茄早疫病对嘧菌酯的敏感性测定 菌株 独立回归方程Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均EC50 MIC LA22 LA20 LA09 LA21 G 18 G 10 G06 YH20 YH09 YH212. 4 抗性菌株抗性水平测定抗性菌株对代森锰锌有低抗、中抗、高抗3种表现型，由此可以统计出浙江省3地番茄对于代森锰锌的敏感菌株水平分布。 表6 浙江省番茄早疫病对代森锰锌的抗性水平分布 敏感类型 抗性水平 菌株数量 /个 百分率 /个 S RL RM RH 3 结果与讨论 （1）实验试验研究中以从未用过任何杀菌剂的里中垅菌株对这3种杀菌剂的平均EC50值作为相对敏感基线，所测地区的菌株与里中垅菌株相比，以此确定浙江省不同地区番茄菌株对于三种常用药剂的抗性水平，从而确定某种药剂对于该地区的防治意义。 （2）敏感性较高的药剂在生产实践中要慎重使用，并应注意