微生物检验方法验证方案.doc

海量资料 超值下载微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查检验方法验证报告微生物检验方法验证方案15微生物限度检查方法验证方案 编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草 起草人： 起草时期： 年 月 日2.验证小组成员： 3.验证方案审核部门审核人日 期生产部生产车间QCQA4.验证方案批准 批准人： 批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“ ”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。3.1.3试验样品： 批号： 批号： 批号： 3.1.4培养基：培养基名称培养基批号配制日期有效期至改良马丁琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基胆盐乳糖增菌培养基 营养琼脂培养基3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115高压蒸汽灭菌30min。3.1.6验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源： 菌株名称内控编号大肠埃希菌CMCC(B) 44102Ec-金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501Bs-白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca-黑曲霉CMCC(F) 98003An-编号由菌名首字母传代代数制备日期组成。3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035下培养1824小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在2328下培养2448小时。将黑曲霉接种至改良马丁液体培养基中，在2328下培养57天。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。4.2实验方法供试液的制备：取样品10g（ml）加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇使分散均匀，或用匀浆仪混匀，制成1：10均匀的供试液。A样品试验组取1：10供试品（相当于1g或1ml供试品）1ml，及各50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注肉汤琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基。B菌液组取上述制备菌液各1ml注入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加入肉汤琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉加入玫瑰红钠琼脂培养基。C供试品对照组取上述1：10供试液1ml注入平皿中，分别倾注肉汤琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基。D稀释剂对照组取PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液各1ml及各50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注肉汤琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基。4.3培养 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在3035下培养48小时，将白色念珠菌、黑曲霉在2328下培养72小时，点计菌落数。5.试验结果5.1产品试验组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.2供试品对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.3稀释剂对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称稀释剂对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.4菌液组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉6.回收率计算6.1稀释剂对照组菌回收率菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率稀释剂对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数100%。6.2试验组菌回收率菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数）菌液组的平均菌落数100%。7.结论：7.1经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为 %、 %、 %、 %、 %。7.2稀释剂回收率为 %、 %、 %、 %、 %。 以上验证结果证明，本品 采用上述方法进行微生物限度检查。检验人： 复核人：8.验证结果评价分析质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书。对验证结果的评审应包括：验证试验是否有遗漏；验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准；验证记录是否完整；验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需进一步补充试验。9.最终审批验证报告由验证组长审核后，报验证总负责人批准，并签发验证证书。验证报告 年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的微生物限度检查方法验证文件对微生物限度检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：验证方案在实施过程中未做修改。验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内。验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实。验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。 片组分或检验条件改变时须重新验证。以上情况，请验证委员会审批！验证小组：年 月 日试验报告审批表验证名称微生物限度检查方法验证编号SOP-V-028验证内容审阅会签质量部审核人： 年 月 日验证委员会意见：批准人： 年 月 日验证证书 验证证书编号： 验 证 名 称： 有 效 期： 上述方法已按验证方案进行验证，各项验证结果符合标准要求，批准按此方法进行本品的控制菌检查。特发此证。 验证总负责人： 年 月 日 备注：微生物限度检查检验方法验证报告验 证 情 况验证概述我公司于年月日年月日对微生物限度检查方法进行了方法学验证，在验证过程中分别取用了大肠埃希菌 CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、白色念珠菌 CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003菌种，对微生物限度的计数方法以及控制菌检查方法进行了验证。为保证验证的准确性，我们同时对其验证过程中使用的纯化水、无菌生理盐水以及设备进行了控制，以保证验证的准确性。按照验证方案中的方法进行验证，以证明其微生物检验方法是可靠的，使其产品的检验更具有说服力。验证时间验证人员负责验证部门质量部人员参加验证部门生产部人员验证结果见“7检测结果”再验证时间年月日验证结论本次验证的验证项目符合方案规定，验证程序合理，验证数据可靠，验证文件可行，验证的数据结果均符合规定标准，证明在检验产品微生物限度时采用该种检验方法能够符合其检验及标准的要求。姓名： 年 月 日验证评价和建议本次验证按照经批准的验证方案执行，验证过程中未对验证方案进行修改，也未产生偏差，验证试验项目无遗漏，验证记录完整，验证数据可靠，验证试验结果符合要求。姓名: 年 月 日批准意见： 姓名： 年 月 日备注 记录表格7.1试验样品样品1样品2样品3名称批号确认人： 日期：7.2 产品试验组微生物生长情况：批号： 菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值12大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉检验人： 日期： 复核人： 日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号： 菌种名称供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值12大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉检验人： 日期： 复核人： 日期：7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号： 菌种名称稀释剂对照组计数结果（cfu/皿）平均值12大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉检验人： 日期： 复核人： 日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号： 菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值12大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉检验人： 日期： 复核人： 日期：7.6稀释剂对照组菌回收率计算菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率稀释剂对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数100%；回收率应均不低于70检验人： 日期： 复核人： 日期：7.7 试验组菌回收率计算菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）菌液组的平均菌落数100%；回收率应均不低于70检验人： 日期： 复核人： 日期：7.8 结果说明经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。7.9 结论以上验证结果证明，本品 （适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。附录微生物检验方法验证方案一 概 述：通过验证以确认所采用的微生物限度检测方法适合于湖南金旺稀贵药业有限公司所生产原料药的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于所生产原料药的控制菌的检查。根据样品特性制定检验方法和检验条件按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。二 目 的：通过验证确认所采用的方法适合于所生产原料药的微生物限度的测定。三 适用范围：本方案适用于本公司生产的四种原料药的微生物限度检验方法的验证。四 责 任 人：验证小组成员及相关人员。五 验证方案内容：1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲菌、白色念珠菌为验证用菌株。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，这三种菌株为细菌计数验证用菌株；黑曲菌为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株。验证用菌株的传代次数不得才超过5代。细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证1.1当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适用于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌级数同时进行。1.2 验证菌菌液制备1.2.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，3537培养1824小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-610-7，制成每1ml含菌数50100cfu的孢子悬浮液。1.2.2 白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，2328培养2428小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释至10-610-7，制成每1ml含菌数50100cfu的孢子悬浮液。1.2.3 黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，2328培养57天，加入35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410-6，制成每1ml含数50100cfu的孢子悬液。1.3 供试液的制备1.3.1 无抑菌活性的供试品供试液的制备1.3.1.1 稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1.3.1.2 液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液 （1：10）。1.3.1.3 固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。1.3.2 具有抑菌活性的供试品试液的制备1.3.2.1 当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：1.3.2.1 培养基稀释法：取供试液2ml，没0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。控制菌检查时可加大增菌液的用量。1.3.2.2 离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。1.3.2.3 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。1.3.2.4 中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。1.4 菌液组：测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。1.5 试验组1.5.1 平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。1.5.2培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平均制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。1.5.3 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。至少要一张膜。1.5.4 离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心35分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂洗地管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。1.6 供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）。1.7 稀释剂对照组若供试剂需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法额、等处理时，应增加稀释剂对照组。用稀释剂代替供试品，加入试验菌。最终浓度为每1ml供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和技术方法计算。1.8 回收率计算1.8.1 试验组回收率计算试验组的菌回收率=100%1.8.2 稀释剂对照组回收率计算试验组的菌回收率=100%计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。1.9. 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的品均菌落数的百分率）70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，是试验组菌回收率大于70%。2. 控制菌检验方法与验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。2.1 验证用菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌为验证用菌株，菌株传代次数不得超过5代。2.2 菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，3537培养1824小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成每1ml含菌数10100cfu的菌悬液。2.3 阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查方法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。2.4 试验组2.4.1 常规法2.4.1.1 大肠埃希菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照组加入大肠埃希菌10100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10100cfu，3537培养1824小时，取此培养物按微生物限度检测标准操作规程大肠埃希菌项下规定检查。2.4.1.2 大肠菌群：取含适量（不少于10ml）的胆盐乳酸发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10100cfu，阴性菌对照计入近换色葡萄球菌10100cfu，3537培养1824小时，按微生物限度检测标准操作规程大肠菌群项下规定检查。2.4.1.3 沙门菌：取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用均浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加沙门菌10100cfu，阴性菌对照加入近换色葡萄球菌10100cfu，3537培养1824小时。按微生物限度检测标准操作规程沙门菌项下规定检查。2.4.1.4 铜绿假