课件：胰腺癌细胞系的表型及基因型介绍.ppt

PPT制作：杨金收,胰腺癌细胞系的表型及基因型介绍,胰腺癌细胞系能够用来进行胰腺癌相关实验的原因 （1）胰腺癌中常见的四种基因（K-ras、p16、p53、Smad4）突变的比例和胰腺癌细胞系中其突变的比例接近； （2）胰腺癌细胞系不同的表型和基因型代表胰腺癌不同的亚类； 利用胰腺癌细胞系进行机制推理和因果实验，比如不同特定蛋白的表达和肿瘤生长、侵犯、转移之间的关系，以及化疗耐药实验。,几种常见胰腺癌细胞系的来源,AsPC-1细胞： 源自胰头癌原发肿瘤 有转移，转移至腹部器官、腹水 分泌：黏蛋白、CEA BxPC-3细胞： 源自胰体癌原发肿瘤 无转移 分泌：CEA、CA199、黏蛋白等 裸鼠移植生长类似患者原位肿瘤 Capan-1细胞： 源自胰头癌肝脏转移灶 有转移，转移至区域淋巴结、肝脏等 分泌：黏蛋白,Capan-2细胞： 源自胰头癌 有侵犯，浸润十二指肠壁远端 CFPAC-1细胞： 源自胰头癌肝脏转移灶（并发囊性纤维化） 有转移，广泛转移至肝脏 CFTR突变：引起先天性胰腺炎新发胰腺癌危险因素（存在争议） HPAC细胞： 源自胰头癌 分化稳定、良好 HPAF-II细胞： 源自胰腺癌腹水癌细胞（转移至肝脏、隔及淋巴结）,几种常见胰腺癌细胞系的来源,Hs 766T细胞： 源自胰腺癌淋巴结转移灶 MIA Paca-2细胞： 源自胰体尾癌原位肿瘤 有侵犯，浸润至主动脉周围 无表达大量CEA且ALP阴性 PANC-1细胞： 源自胰头癌原位肿瘤 有转移，转移至胰周淋巴结 未检测到CEA SU.86.86细胞： 源自胰头癌肝脏转移灶 有转移，广泛肝脏转移,细胞的粘附性,细胞的粘附性是通过细胞外基质和细胞表面分子接触介导的： 纤连蛋白，一种发现于基底膜和结缔组织的糖蛋白 I型和IV型胶原蛋白，发现于组织间质和基底膜 层粘连蛋白，基底膜中主要的非胶原蛋白 相关研究： Capan-1比Mia-paca-2更易连接到I型胶原蛋白 Capan-1和Mia-paca-2对层粘连蛋白的粘附性无明显差异，有研究也表明Capan-1稍逊 Bxpc-3和panc-1对I型胶原蛋白粘连性近似 Bxpc-3和panc-1对层粘连蛋白粘附性近似，有研究也表明，Bxpc-3更强,细胞的粘附性,影响研究差异的变量： 细胞定量技术的不同，如分光光度法和光学显微镜的差异 细胞培养条件 对细胞外基质的处理方法 对研究者建议： 注意引用既有的研究，认真阐明不同细胞系的黏附特性,细胞的迁移和侵犯,相关实验方法： 细胞增殖实验 MTT CCK8 细胞迁移实验 transwell using Boyden chambers wound-healing cell migation assay（细胞划痕实验） 细胞侵犯实验 transwell（特定基质） *特定基质：人工基质胶（包括层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白、硫酸肝素）,细胞的迁移和侵犯,细胞迁移性在癌细胞转移中发挥重要作用。 细胞迁移相关研究： Panc-1（多是单细胞迁移）比bxpc-3（多是整个细胞团的迁移）有5倍的能动性 Panc-1细胞在I型胶原蛋白transwell中比bxpc-3能动性更好 HPAF-II比bxpc-3能动性好 高侵犯癌症的患者发现时，多是晚期转移性疾病，严重影响患者的预后。 细胞侵犯相关研究： Capan-1和mia-paca-2在人工基质胶中有相似的侵犯特性 Bxpc-3比mia-paca-2有更强的侵犯能力，有研究也表明二者近似 Panc-1比mia-paca-2有更强的侵犯能力，有研究也表明mia更强,细胞的迁移和侵犯,影响研究差异的变量 检测侵犯性能的试剂 细胞培养条件 细胞培养时间 细胞定量技术 对研究者建议 在得出实验中侵犯能力的的结论时，首先阐明本实验细胞系的侵犯特点。,血管生成能力,肿瘤微血管密度（TMVD）是至关重要的肿瘤发展和患者生存的预测指标，在大部分肿瘤中（如乳腺癌、前列腺癌）介导心血管的生成。肿瘤的增殖和心血管的生成密切相关，其促血管生成因子多于抗血管生成因子，其中的促因子如血管内皮生长因子和胰腺癌的TMAD密切相关。促血管生成因子的高表达不仅促进中肿瘤血管生成，而且能够促进肿瘤细胞有丝分裂的进行。 促血管生成因子： 细胞因子，如IL-1、IL-8 趋化因子， 酶类 其他肿瘤产物,COX-2在促进肿瘤血管生成中的作用： 促进AA转化为PGE2，PGE2为一种血管生成因子 PGE可激活NF-kB NF-kB可以促进COX-2的转录和翻译,IL-8可以介导细胞增殖和血管内皮细胞趋化运动，从而促进肿瘤的生长,血管生成能力,相关研究： BxPC-3, Capan-1,Capan-2 and HPAF-II可表达COX-2， 而AsPC-1, MIA PaCa-2、PANC-1无表达，其中尤其是Capan-2表达大量的 COX-2； BxPC-3 表达高水平的IL-1 and IL-8 ，但是Capan-2 和MIAPaCa-2 表达低水平的IL-8 和不可检测的IL-1； 总结：BxPC-3 和 Capan-1 表达高水平促血管生成因子，而AsPC-1 和MIA PaCa-2 表达低水平的促血管生成因子 建议：检测肿瘤细胞系中促血管生成因子的表达，可以用作反映肿瘤血管生成能力的指标。,成瘤能力（体内）,评估致瘤性： 肿瘤体积 肿瘤质量 发生概率 生长速度 移植瘤方法： 皮下注射胰腺癌细胞（免疫缺陷小鼠） 腹膜内注射/静脉注射肿瘤细胞 原位移植 移植肿瘤组织-供体源自皮下移植瘤小鼠 移植肿瘤细胞-源自人胰腺癌细胞,成瘤能力（体内）,皮下注射相关研究 Bxpc-3成瘤比PANC-1大，也有研究表明PANC-1成瘤较大； Capan-1注射后14周即发展成为肿瘤，bxpc-1和panc-1则超过4个月成瘤； bxpc-3注射后潜伏期40天才开始生长，capan-1则需10天潜伏期开始生长；panc-1成瘤潜伏期为4周，mima-paca-2成瘤潜伏期需3周 腹膜内注射相关研究： 在严重联合免疫缺陷小鼠体内注射癌细胞后，成瘤概率为capan-1-100%、panc-1-86%、mia-66% 在肿瘤体积大小研究中：miacapan-1panc-1 总结： Bxpc-3和panc-1细胞在开始生长成瘤前有更长的潜伏期 Capan-1细胞在皮下和腹膜下均较易成瘤,成瘤能力（体内）,原位移植肿瘤组织相关研究： 不同细胞系成瘤概率均为100% 研究表明移植瘤体积，mia-paca-2capan-2，其他研究，HPAF-IIMia-paca-2panc-1Aspc-1 Q：因在供体皮下已经建立血液循环和肿瘤微环境，用来研究肿瘤早期的发生发展无充分说服力 原位移植肿瘤细胞研究： 不同细胞系成瘤的概率：AsPC-1: 100% (10/10), CFPAC-1: 100% (10/10), HPAFII:100% (8/8), Capan-2: 90% (9/10), Hs 766T: 90% (9/10), HPAC: 88% (7/8), PANC-1:80% (8/10), and BxPC-3: 67% (6/9) Mia-paca-2成瘤体积大于HPAC细胞 Mia-paca-2和Aspc-1注射后在2、5周有相似的生长特点 总结： 胰腺癌细胞，不同的移植方法，其致瘤性不同,基因型特点,常见的基因突变： KRAS TP53 CDKN2A (p16 /p16INK4a) SMAD4 (DPC4） 有研究表明，这四个基因的突变和胰腺癌细胞的分化程度或生物学行为无联系。 也有研究证实，肿瘤转移性和P53基因改变有关。所以，基因型和表型之间也许有一定联系。,基因型特点 KRAS基因,Kras突变几乎发生在所有胰腺癌原发肿瘤中，与肿瘤早期发展有关。 致癌机制： 12、13或61密码子突变抑制Ras蛋白内在的GTP酶，导致ras蛋白和GTP酶处于连接且持续激活状态 Ras蛋白介导了多个下游信号通路，如Raf-mitogen-activited 蛋白酶信号通路、akt-蛋白酶B信号通路 相关研究 密码子12突变在多个细胞系总发生，除了Hs766T和BXPC-3，其他研究表明，SW979也没有RAS的突变 但有些研究表明，Hs766T有高水平的RAS基因的突变 总结： BxPC-3细胞系Kras基因为野生型，无RAS的激活* BxPC-3细胞不能代表大部分胰腺癌细胞,基因型特点 CDKN2A/p16基因,P16基因的失活发生在98%以上的胰腺癌患者中，可发生在40%的胰腺上皮内瘤变中，其被认为是胰腺癌早期阶段发展的重要原因。 失活机制： 基因突变（16%） 纯合子缺失（12%） 启动子甲基化造（ 52% ） 相关研究： Capan-1和panc-1包含有纯合子的缺失，HPAF-II为框内缺失，HPAC有外显子2的突变 Bxpc-3细胞p16为野生型，但是不能检测出p16蛋白，原因：2-3外显子的纯合子的缺失。 AsPC-1, Capan-2 和 Hs766T细胞p16也为野生型。 总结： 基本上所有的胰腺癌细胞系都有各种原因的p16基因的失活。,基因型特点 TP53和Smad4基因,TP53基因（抑癌基因）突变发生在50%左右的胰腺恶性肿瘤中，与肿瘤后期的进展相关。 TP53相关研究： P53和p16在细胞周期G1/S期中发挥重要的检查和修复作用 P16和p53的高突变率凸显了在胰腺癌发生发展中G1/S期检查位点废除的重要性。 Smad4基因（抑癌基因）是TGF-家族的一员，在大约48-55%的胰腺癌中发生突变，与胰腺癌后期的发展相关。 Smad4相关研究： BxPC-3, CFPAC-1和 Hs766T由于纯合子确实， 缺乏SMAD4/DPC4 蛋白 Capan-1 细胞的SMAD4/DPC4由于点突变而失活， Capan-2, MIA PaCa-2, PANC-1和SU. 86.86 88细胞中无Smad4基因的失活 Aspc-1细胞研究表明为野生