《酶工程作业》doc版.docx

酶分离纯化研究进展摘要：微生物酶作为生物催化剂，因具备底物特异性，位置特异性，立体特异性等催化特点，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题，在诸多领域有着广泛的运用。酶分离纯化的方法有：离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。关键词：离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离。1离心分离1.1离心分离的概念 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小，不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离是，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小，密度和特性的不同选择适当的离心机，离心方法和离心条件。1.2离心机的选择表1-1离心机的选择离心机种类离心机基本参数离心机作用常速离心机最大转速：8000r/min相对离心力（RCF）1104g以下主要用于细胞，细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机最大转速（1-2.5）*104r/min RCF:1*104-1*105g主要用于沉淀，细胞碎片和细胞器等的分离。超速离心机最大转速（2.5-12）*104r/min RCF: 5*105主要用于DNF，RNA，蛋白质等生物大分子以及细胞器，病毒等的分离纯化，样品纯度的检测，以及沉降系数和相对分子质量的测定等。 1.3离心方法的选用对于常速离心机和和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和立新时间，就能达到分离效果；如果希望从样品液中分离出两种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心，密度梯度离心或等密度离心等方法。2沉淀分离 1.1沉淀分离的方法表2-1沉淀分离的方法沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使2酶和杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离 3过滤与膜分离3.1概念和分类过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。根据过滤介质的不同，可将过滤分为膜过滤和非膜过滤两大类。其中粗滤和部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤；而大部分微滤以及超滤，反渗透，透析，电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称为膜过滤，又称为膜分离技术。表3-1过滤的分类及其特性类别截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤 2m 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等 微滤0.22m 细菌、灰尘等 微滤膜、微孔陶瓷 超滤200.2m 病毒、生物大分子等 超滤膜 反渗透 20 生物小分子、盐、离子 反渗透膜 4层析分离4.1层析分离的基本概念 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力，分配系数等）的不同，使各组分以不同比列分布在两相中。 层析分离设备简单，操作方便，在实验室和工业化生产中都有广泛应用。4.2层析分离方法表4-1层析分离方法层析方法分离原理吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）形成离子键的能力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 5新兴的酶分离纯化技术5.1反胶团萃取技术5.1.1反胶团萃取的结构 反胶团（reverse micelle）是表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体。通常表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶团浓度时，表面活性剂就会在水溶液中剧集在一起而形成聚集体。通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶团，称为正常胶团。在胶团中，表面活性剂的排列方式是极性头在外，与水接触，非极性尾在内，形成一个非极性的核。此核可以溶解非极性物质。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶液中，并使其浓度超过临界胶团浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶团。图5-1正常胶团和反胶团结构比较5.1.2反胶团萃取技术的优点（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；（2）分离