课件：实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质.ppt

实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离血清蛋白质,掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用,实验目的,聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。,实验原理,由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。 Bis：交联剂 过硫酸铵(AP) ：引发剂，提供自由基， 引发聚合反应 四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂, 加快引发 释放自由基的速度,聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：,1. 浓缩效应,分离机制：,凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径,pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7； 分离胶pH=8.9,缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中 Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间,电位梯度不连续,有效迁移率 = 迁移率 解离度,电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩,2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 3.电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。,实验仪器及试剂,电泳装置,稳压电源,盘状电泳槽,毛细滴管,刻度吸量管,灯泡瓶,玻璃管和橡胶帽,微量移液器,注射器和长针头,脱色摇床,TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。 过硫酸铵(新鲜配制) 染色液：0.1溴酚兰液 洗脱液：7醋酸 其他试剂：见下表贮存液的配制。,Acr和Bis：棕色瓶保存,实验步骤,1. 每人取电泳管1支，加1滴40蔗糖于橡胶帽内，堵住电泳管底部，塞紧。 2. 制备分离胶： （可灌胶12支） 1号2ml 2号4ml 水2ml,在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；,加3号8ml，混匀备用,最后加,用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口2cm处，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层，垂直静置至再次出现界面时表明凝胶已经聚合。,3. 分离胶的灌制,4. 制备浓缩胶：（可灌胶12支） 4号 1ml 5号 2ml 6号 4ml,在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡；,加3号1ml，混匀备用,最后加,5. 吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm。垂直放置至成胶。,6. 成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。,7. 样品制备,血清：1-2滴 40%蔗糖：1滴 0.05%溴酚兰：1滴,于EP管中混匀备用,倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul，加在浓缩胶上。,8. 上样,9. 电泳,上槽负极；下槽正极,稳流：1.5mA/管，3min 2.5mA/管，约1h，至玻管3/4处,10. 剥胶,电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。,11. 固定和染色,用7%醋酸固定3min； 用0.1%溴酚蓝碱性液染色5min（染色液回收）； 用洗脱液(7%醋酸)漂洗脱色,12. 观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常,实验结果,+,丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂， 对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。 注意观察实验现象：分界面，浓缩效应. 溴酚蓝染色脱色染液回收。 固体胶切忌倒入水池。,注意事项,思考题,1. 圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？ 2. 圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什么？,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a proj