课件：病生调亡.ppt

apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡与疾病,凋亡在疾病防治中的意义,凋亡概述,apoptosis,研究历史 定义 与坏死的区别 生理意义,概 述,概 述,3,1842年 Vogt在研究蝌蚪发育时，发现一种不同于细胞坏死的细胞死亡现象。 1885年 Flemming在研究卵巢滤泡时再一次发现了有不同于细胞坏死的细胞死亡现象，并指出这种细胞死亡是生物体生理机能的一部分。 1887年 Flemming将自己的发现的这种细胞死亡命名为染色质溶解死亡，并对死亡现象做了精彩的形态描述。 1887年 德国的科学家Graper在一篇关于线粒体论文中再次提到Flemming的发现。,1. 概 述 一、细胞凋亡的研究历史,4,1965年 发育生物学家Lockshin在研究蛾发育过程中首次提出程序化死亡（programmed cell death ）概念。 1972年 Kerr首次提出细胞凋亡（apoptosis）的概念。 1973年 首次在细胞凋亡中发现DNA的降解。 19731987 形态学描述和生物化学研究阶段。 -至今 细胞凋亡进入分子阶段的研究，在此间发现细胞凋亡的相关的调控基因；发现细胞凋亡的抑制剂；认识线粒体在凋亡中的重要作用；发现细胞凋亡的诱导因子；尤其近几年细胞凋亡进入临床应用阶段。,1. 概 述,5,Sydney Brenner 1/3 of the prize United Kingdom The Molecular Sciences Institute Berkeley, CA, USA b. 1927 (in Union of South Africa),H. Robert Horvit 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA b. 1947,John E. Sulston United Kingdom The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge, United Kingdom b. 1942,THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER,6,1. 概 述 二、细胞凋亡的概念 细胞凋亡（Apoptosis ） 在一些体内外因素 诱导下，细胞内的死亡程序被激活，而引发的有序 的细胞死亡。 又称为程序性细胞死亡（programmed cell death）； 凋亡有其独特的形态学和生物化学改变。,1972年英国Aberdeen大学病理系 Kerr教授 和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的散在 细胞死亡方式， 联想到秋日落叶特征， 命名为 “apoptosis”。,三、凋亡与坏死的区别,特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应,一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。,1. 概 述,8,凋亡与坏死的差异比较,四、细胞凋亡的生理意义, 确保正常发育、生长 维持内环境稳定 发挥积极的防御功能 所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。,概 述,细胞凋亡的生理意义, 确保正常发育、生长 维持内环境稳定 发挥积极的防御功能 所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。,apoptosis,概 述,apoptosis,生化改变,凋亡过程与调控,凋亡时细胞的主要变化,形态学改变,14,一、细胞凋亡的主要特征 （一）形态学改变 1. 细胞固缩（condensation, shrinkage） 细胞表面微绒毛消失，与周围细胞脱离；胞质浓缩，胞膜空泡化，细胞体积缩小、出现固缩；,15,2. 核边集（margination）： 核染色质高度浓缩，融合成团并向核膜下聚集， 呈新月形或环形分布，也可呈马蹄、镰刀等形状 排列；或向中心集中（即中聚形成黑洞样）。,新月状,八字形,花瓣状,环 状,球 状,黑洞样,16,Transmissional Electron Microscopy,对照,凋亡,凋亡,坏死,17,3. 出芽（budding）及形成凋亡小体（apoptotic body）： 骨架与胞浆膜脱耦联，包膜向外不规则膨出，包裹线粒体等细胞器、空泡化的胞浆及裂解的高浓度核物质，最终脱落形成多个外有膜包裹、内有不能外溢内涵物的凋亡小体，其大小不一，圆形或椭圆型或不规则型。,18,4. 识别并被吞噬清除： 专职吞噬细胞（如单核巨噬细胞）或邻近固有的组织细胞（如上皮细胞、内皮细胞、肿瘤细胞）或自然脱落离开生物体，不伴有局部炎症反应。,19,细胞凋亡的形态学改变,20,21,（二）生化改变 1.DNA片段化：凋亡诱因 激活凋亡蛋白酶（Caspase） 激活内源性核酸内切酶 裂解DNA，形成180-200bp整数倍的寡核苷酸片段 电泳呈梯形条带（ladder pattern)。,22,（二）生化改变,DNA Ladder from,23,（二）生化改变 2.内源性核酸内切酶 Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶，Zn2+抑制其活性。,正常细胞中，CAD （Caspase激活的DNA酶）与ICAD （Caspase激活的DNA酶抑制物）结合而无活性。 Caspase裂解ICAD使CAD游离而活化分解 DNA使其片段化。,24,（二）生化改变 3. 凋亡蛋白酶（Caspase蛋白家族） （Cysteine-containing aspartate-specific proteinase） 结构含半胱氨酸，可在天冬氨酸（Asp）残基后 切断肽链的蛋白酶家族，其相应基因用 CASP 表示。 1、酶原结构（Procaspase) ： 含N末端结构域、20Kd大亚基和10Kd小亚基。,25,2、酶原活化： Caspase酶原 水解 N-端前肽 亚基之间切断 大、小亚基分离 组成活性四聚体,26,3、Caspase的分类： （1）凋亡启动酶：Caspase 2、8、9、10 前体部分含与其它接头蛋白结合的特异区，分别与凋亡启动酶、死亡受体的死亡区结合。,27,死亡诱导信号复合物,28,3、Caspase的分类： （2）凋亡效应酶：Caspase 3，6，7 前体部分小不含蛋白结合区，分解细胞蛋白（凋亡执行器）。 （3）ICE（IL-1 converting enzyme）亚类 Caspase 蛋白酶： Caspase1、4、5、11、12、13、14。 参与凋亡但不起主要作用,29,4. 功 能 凋亡信号激活Caspase酶原级联反应，是细胞凋 亡的共同通路。 FasL与靶细胞Fas受体结合 激活Caspase8酶 原 Caspase3,6,7 级联放大。 不同Caspase介导不同的凋亡信号通路： Caspase8 死亡受体相关的凋亡； Caspase9 细胞毒因子诱导的凋亡； Caspase12 内质网应激途径的凋亡,细胞凋亡的过程与调控,细胞凋亡的过程,apoptosis,凋亡过程与调控,受体,cAMP Ca2+ 神经酰胺,凋亡相关基因激活,信号转导,细胞膜,细胞核,Dnase激活 Caspases激活,apoptosis,凋亡过程与调控,DNase激活,Caspases激活,凋亡细胞的清除,凋亡执行,34,一、细胞凋亡相关因素 （一）诱导性因素： 1. 理化因素：射线、缺血缺氧、抗癌药； 2. 生物因素：细菌及病毒； 3. 激素和生长因子水平失衡； 4. 免疫因素：一些免疫分子诱导靶细胞凋亡。 （二）抑制性因素: 1. 某些细胞因子(IL-2、神经生长因子)； 2. 某些激素（ACTH、睾丸酮、雌激素）； 3. 其他：Zn2+、病毒（EB）、苯巴比妥等。,二、细胞凋亡的信号转导,多途性：同一凋亡诱导因素可通过多条信号转导途 径触发凋亡。,多样性：不同种类的细胞有不同的信号转导系统,偶联性：死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程 中的信号转导系统在某些环节上有交叉、偶联。,同一性：不同的凋亡诱导因素可通过同一信号转导 途径触发凋亡。,凋亡诱 导因素,凋亡信 号转导,死亡程 序激活,apoptosis,特点：,36,二、细胞凋亡的信号转导 可分为： 死亡因子及其受体介导的凋亡； 线粒体损伤启动的细胞凋亡。 (一) 死亡因子及其受体介导的细胞凋亡 1.死亡因子及其受体 死亡因子（death factor）：TNF、FasL、TNF-相关凋亡诱导性配体。 死亡受体（death receptor, DR）：Fas、TNFR 为跨膜蛋白，胞外C端是配体结合区，胞浆N端含死亡结构域（death domain, DD）。,37,2. 信号转导 死亡因子（TNF、FasL ） 与受体结合 受体三聚体 与接头蛋白结合 激活Caspase8 引发级联反应 细胞凋亡,胞内信号途径,40,(二) 线粒体损伤启动的细胞凋亡 1. 线粒体膜通透性转换（permeability transition pore,PTP） ： 凋亡因子 线粒体跨膜电位、电子传递脱耦 联 PTP开放 膜通透性，线粒体释出AIF 、CytC、Apaf 凋亡。 AIF （细胞凋亡诱导因子）可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性； 细胞色素C ( CytC ) 与Apaf（凋亡蛋白酶激活因 子）相互作用激活Caspases9 激活Caspases 3，6。,41,2. 活性氧及胞内Ca2+改变： 线粒体损伤 氧化应激 胞内活性氧及 Ca2+i 损伤DNA由野生型p53基因介导凋亡； 损伤膜结构脂质过氧化反应； ATP使钙泵失灵促进Ca2+i激活核酸内切酶或蛋白激酶C (PKC) 等途径，介导凋亡。,44,三、凋亡相关基因 凋亡相关基因指可诱导或阻止细胞凋亡的基因。 抑制凋亡基因：Bcl-2（属于Bcl-2家族）； 促进凋亡基因：Bax，Bid，P53 ； 对凋亡双向调控基因：C-myc，Bclx。,45,（一） B细胞淋巴瘤/白血病-2家族 （ B cell lymphoma/leukemia-2 ， Bcl-2家族） 含1个或多个BH（homologous domain）结构域： 1. Bcl-2亚家族：Bcl-2、Bcl-xl、 Bcl-w等（抑制）； 2. Bax亚家族： Bax、Bak、Bok等（促进凋亡）； 3. BH3亚家族：Bad、Bid 、Bik、Hrk等（促进）。 存在：造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、癌细胞等。 定位：细胞膜、线粒体膜和内质网膜。,46,Bcl-2抑制凋亡的作用机制： （1）调节PTP活性 降低线粒体膜通透性，阻止Cyt-C释放，可与Apaf-1直接结合而阻止Caspase-9的激活； （2）与凋亡促进蛋白Bax形成异二聚体，抑制Bax的促凋亡作用； （3）减少内质网Ca2+释放，限制核内 Ca2+ 持续； （4）抑制Caspase的活化。,47,（二）野生型P53基因（ “分子警察” ） 野生型P53基因： 表达产物P53蛋白是DNA结合蛋白，G1期负责 监测DNA损伤并启动修复机制，维持细胞基因 的完整性。若不能修复，则促进细胞凋亡而减 少带有缺损或突变基因的继续存活，被誉为 “基因警卫”。 突变型p53基因： 编码的p53蛋白对细胞凋亡有抑制作用。,48,DNA严重受损后，P53大量表达，诱导细胞凋亡,Bax、Fas、 Apaf-1、 DR5、,50,（三）C-myc和Bcl-X 双向调控凋亡，取决于刺激种类和生长环境； C-myc基因表达，若无足够的生长因子刺激 细胞凋亡； Bcl-X基因可翻译出2种蛋白 Bcl-XL（抑制凋亡）； 而Bcl-Xs（促凋亡）。,四、细胞凋亡的执行,特点：cysteine-containing aspartate-specific protease（含半胱氨酸的天门冬氨酸特异水解酶）,apoptosis,凋亡过程与调控,和凋亡有关的两个酶,作用：切割染色质DNA,DNase,特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活性,Caspases,作用：灭活凋亡抑制物,水解蛋白质结构，形成凋亡小体,水解凋亡相关活性蛋白,Caspases家族简介,1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第1个Ced-3同源分子，叫白细胞介素-1转换酶（Interleukin-1 Converting Enzyme，ICE），Pro-ICE含404个氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化产生20KD和10KD二个片段，聚合形成（p20）2(p10)2杂四聚体，为活化的ICE。到1998年底为止共发现有14个Ced-3同源分子，分别定名为Caspase1-14。,使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD 破坏细胞结构，如Lamina 将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin,Caspase 如何杀死细胞？,五、凋亡细胞的清除,吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬,吞噬细胞凝集素（lectin） 血小板反应蛋白 磷脂酰丝氨酸受体,apoptosis,细胞凋亡与疾病的关系 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病， 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染 不足与过度并存：动脉粥样硬化,凋亡与疾病,57,一、肿瘤 增殖过度而分化不足、凋亡受抑发生肿瘤。 突变型P53、野生型P53缺失使肿瘤发生率 （在肺癌中，发生率上升5080%）； bcl-2基因的高表达与肿瘤的恶化程度与预后密切 相关（前列腺癌、结肠癌等）； 肿瘤细胞Fas低表达，降低肿瘤细胞凋亡； 肿瘤细胞分泌FasL淋巴细胞凋亡肿瘤细 胞逃脱免疫攻击。,58,二、自身免疫性疾病 发育中清除针对自身抗原的免疫细胞。 细胞凋亡在T细胞发育中的作用： 胸腺细胞正选择：同MHC多肽复合体异己抗原起反应 的T细胞保留和存活； 胸腺细胞负选择：同MHC多肽-自身抗原复合体起反应的T细胞通过凋亡而去除（可预防自身免疫病）。,自身抗体 致敏T淋巴细胞,含自身抗原细胞,自身组织损伤 临床症状,凋亡,59,多发性硬化症 胰岛素依赖性糖尿病 系统性红斑狼疮 慢性甲状腺炎,细胞免疫应答过程中，靶细胞死亡的重要方式是Fas-FasL途径的凋亡 机制：淋巴细胞Fas抗原和FasL表达减弱或缺陷，阻碍胸腺细胞负选择； Bcl-2过表达,糖皮质激素可诱导异常存活的自身免疫性T细胞凋亡,60,三、心血管疾病 1. 心脏传导障碍与心律失常,（1）发育中P细胞凋亡，残存P细胞能产生自主心律（某些心律失常患者随着年龄增长，心律失常可自行消退，与延迟凋亡有关）； （2）发育中P细胞过度凋亡 不稳定电活动，心源性猝死。,61,2. 心力衰竭 内毒素、过度负荷、缺血缺氧等 心肌细胞、心肌成纤维细胞高表达TNF-心肌细胞 凋亡 心功能，心力衰竭。 3. 心肌缺血-再灌注损伤 缺血、氧自由基、Ca2+超载等均为凋亡诱因 缺血早期以凋亡为主，晚期以坏死为主； 轻度缺血以细胞凋亡为主，重度以坏死为主； 缺血-再灌注的一定时间内，发生的凋亡比单纯缺血更严重； 细胞凋亡有可能通过干预加以挽救 。,62,缺血性心脏病 (ischemic heart disease) 、 心力衰竭 (heart failure) 、 心律失常 (arrhythmia) 、 心肌病 (cardiomyopathy) 、 动脉粥样硬化（artherosclerosis）、 高血压（hypertension）等心血管疾病 其发生均与凋亡密切相关。,63,四、神经元退行性疾病 阿尔茨海默病 (Alzheimers disease,早老性痴呆) 帕金森病、 肌萎缩性侧索硬化症、 脊肌肉萎缩、 小脑退行性病、 遗传性视网膜退行性变 凋亡在神经元退行性疾病发生机制中起重要作用。,64,四、神经元退行性疾病 阿尔茨海默病 (Alzheimers disease,早老性痴呆),海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达30-50 大脑皮质神经元丧失、脑萎缩 脑实质有大量淀粉样蛋白及神经原纤维缠结,机制： 氧自由、神经元内钙增多、淀粉样蛋白增多 临床上采用钙拮抗剂（尼莫地平）治疗， 能延缓神经元的死亡，AD症状可得到改善。,五、病毒感染,HIV,感染HIV的宿主细胞膜上表达一种gp120糖蛋白， 与CD4淋巴细胞表面的受体结合，触发凋亡,2. 感染HIV的CD4 细胞逐步融合成合胞体或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后即可发生凋亡解体。,3. Fas基因表达上调，使CD4细胞对Fas介导的细胞凋亡敏感性增加，易发生凋亡,4. T细胞激活 ，与凋亡有共同的信号传递系统，缺乏足够的细胞生长因子时，引起凋亡,5. 巨噬细胞分泌TNF，与TNF受体（死亡受体）结合，启动凋亡，或产生氧自由基,66,受感染的细胞产生tat蛋白，透过细胞膜，使CD4+细胞 内氧自由基生成增多，增强Fas抗原表达，细胞对凋亡 的易感性升高,7. 慢性感染期，受感染的CD4+淋巴细胞作为效应细胞，诱导未受感染的CD4+淋巴细胞凋亡,8. HIV可诱导B细胞，CD8+淋巴细胞，巨噬细胞凋亡,意义：,终止病毒复制和表达,67,五.细胞凋亡不足与过度并存性疾病 动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 动脉内膜和内膜下脂质沉着，中层平滑肌细胞向内 膜移行增殖，内膜增厚形成粥样病灶或纤维脂质斑块。 AS发生中：血管内皮细胞凋亡（为34.0%远高于 对照组8.0%）；血管平滑肌细胞增殖、凋亡（为 29%远高于对照组0.06%，增殖占优势 ）。,68,4.细胞凋亡在疾病防治中的意义 通过调控（抑制或促进）细胞凋亡，防治疾病。 1、合理利用凋亡相关因素 （1）诱导凋亡（射线、高温），治疗肿瘤。 （2）抑制凋亡（生长因子、激素），治疗退行性病变 2、干预凋亡信号转导来调控凋亡，治疗疾病 （1）阿霉素刺激肿瘤细胞表达Fas/FasL使细胞相互交联，促进肿瘤细胞凋亡； （2）磷酸鞘氨醇（SPP）具有转递增殖信号拮抗凋亡作用，防止神经元凋亡。,69,3、调节凋亡相关基因来影响凋亡 导入野生型P53基因诱导肿瘤细胞凋亡，抑制或封闭Bcl-2表达提高肿瘤细胞对抗癌药物敏感性。 4、控制凋亡相关酶来影响凋亡 调控caspase、核酸内切酶活性影响细胞凋亡。 5、防止线粒体跨膜电位的下降，抑制凋亡 环孢菌素A能稳定线粒体膜电位抑制凋亡。,70,教学要求,1. 掌握细胞凋亡的概念及特征性的变化。 2. 熟悉细胞凋亡的调控因素及发生机制。 3. 了解细胞凋亡的生物学意义及凋亡与疾病发生进展的关系。, 细胞凋亡不足 肿瘤：凋亡抑制基因Bcl-2基因过高表达-凋亡衰减（前列 腺癌） 促凋亡基因如p53基因突变或缺失，肿瘤发生率 自身免疫病 自身抗原受到自身抗体或致敏T淋巴细胞的攻击而损伤 T、B淋巴细胞通过正选择和负选择才能发育、分化成熟 负选择：凋亡清除针对自身组织抗原和TCR的双阳性细胞 正选择：保留能够识别自身组织抗原的T细胞，并增殖成熟,如果负选择机制失调，针对自身组织抗原的T细胞存活、增殖， 产生自身免疫病。, 细胞凋亡过度 心血管疾病 心力衰竭 心肌缺血与再灌注损伤 坏死与凋亡共存 发生机制：氧化应激；细胞内钙超载； Fas受体上调；p53基因转录增强 凋亡特点：早期凋亡为主，晚期坏死为主 梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重度缺血则常常发生坏死 IR引起的细胞凋亡有时比单纯缺血更严重,神经元退行性疾病 特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer disease AD） AD主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结 机制： -淀粉样蛋白基因位于21号染色体，当钙超载、氧化应激或神经生长因子分泌不足时， Ca2内流增加，激活与-淀粉样蛋白合成有关的基因，使-淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激活周围的M释放细胞因子和炎性介质促进凋亡的发生,病毒感染 病毒感染宿主细胞后有两种结局： 一是诱导细胞 凋亡从而限制病毒生长（肝炎病毒）； 二是由病毒基因表达的蛋白抑制宿主细胞凋亡，造成持续性感染或增加某些病毒的致癌可能性。 AIDS:由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞被破坏，导致CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。 CD4+淋巴细胞与HIV感染者病情发生发展有密切关系，它决定感染者是否发病和发病的速度和严重程度。,HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素： 1）HIV的基因产物GP120能直接启动CD4+淋巴细胞的死亡程序 2）合胞体形成： 3）Fas基因表达上调 4）T细胞激活 激活诱导的细胞死亡