正交设计优化桔梗总皂苷提取工艺 中医学院本科毕业论文.doc

安徽中医学院本科毕业论文（设计）正交设计优化桔梗总皂苷提取工艺姓 名： 周 友 军 专 业： 药 学 学 号： 06312060 指导老师： 桂 双 英 职 称： 教 授 实习单位：安徽中医学院药学院药剂教研室 安徽中医学院药学院 2010年5月安徽中医学院药学院本科毕业生毕业论文（设计）承诺书本人按照毕业论文（设计）进度计划积极开展实验、实践研究活动，实事求是地做好实验、实践记录，所呈交的毕业论文（设计）是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中特别加以标注引用参考文献资料外，论文（设计）中所有数据均为自己研究成果，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的工作已在论文中作了明确说明并表示谢意。毕业论文（设计）作者签名： 毕业论文（设计）指导教师签名： 日期： 目 录中文摘要.3英文摘要.4前言.51 实验材料.51.1 药材.51.2仪器.51.3试剂.52 方法与结果.62.1 桔梗总皂苷的测定方法.62.1.1 对照品的配制.62.1.2 供试品溶液的制备.62.1.3 含量测定.62.2 浸膏得率测定方法.62.3 正交试验设计.62.3.1 药材吸水率考察.62.3.2 正交试验设计.62.3.3 正交试验及结果分析.72.4 验证实验.83 讨论.9参考文献.10致谢.11综述.12 中文摘要目的：优化桔梗药材中桔梗总皂苷的提取工艺。 方法：采用紫外可见分光光度法，以提取物中桔梗总皂苷含量和浸膏得率为考察指标，应用正交实验法对提取工艺进行优化。 结果：桔梗药材中桔梗总皂苷的最佳提取工艺为6倍量水提取3 次，每次2h。 结论：该工艺简便易行，生产成本低， 适合工业生产。关键词 桔梗总皂苷；提取工艺；正交实验 ABSTRACTStudy on extraction of total-saponins from Platycodon grandif by orthogonal designObjective: To study the optimum extraction of total-saponins from Platycodon grandif. Methods: The extraction amount of total-saponins and the extraction rate of extractum were chosen as the assessment index ，number of extraction was studied, then with water concentration, solvent volume, the extraction time and extraction times as examming factor and the optimum extraction progress were selected with the orthogonal design. Results: The optimum extraction technology was that using water, the amount of which were 6 times of crude drugs, to extract the drugs 3 times ,2.0 h respectively. Conclusion: The optimum extraction technology could extract the total-saponins efficiently from Platycodon grandif.Key words Orthogonal design; Total-saponins; Extraction process 正交试验设计优化桔梗总皂苷提取工艺前言：桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandif1orum ( Jacq. )A. DC.的干燥根，其主要活性成分为桔梗皂苷。桔梗性平，味苦、辛，具有宣肺，利咽，祛痰，排之功效，用于咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛音哑等 1。现代药理学研究表明，桔梗皂苷具有抗炎、祛痰、保肝、降血糖、抑制脂肪吸收、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等广泛的药理作用3。目前, 提取桔梗总皂苷的主要方法有水提法、超声法、超临界CO2提取法等4。为了制定科学经济的桔梗最佳提取工艺，本文以桔梗总皂苷为考察指标，采用正交实验法对桔梗的提取工艺进行研究。1 实验材料1.1 药材品名：桔梗批号：90721生产企业：安徽海鑫中药饮片有限公司1.2 仪器UV757紫外可见分光光度计（上海精科）DZF-200型真空干燥箱（上海浦东跃欣科学仪器厂）AG285型电子天平（德国METTLER公司）旋转蒸发器RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）玻璃仪器1.3 试剂桔梗皂苷D A0321（成都曼斯特生物制品有限公司）其他试剂均为分析纯2 方法与结果2.1 桔梗总皂苷含量测定方法2.1.1 对照品溶液的配制精密称取桔梗皂苷D对照品 4.03 mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度（0.403mg/ml）。2.1.2 供试品溶液的制备精密移取相当于0.5g药材量的水提液1ml，加水至20ml,使其充分溶解，用水饱和的正丁醇溶液萃取5次，每次20ml,合并正丁醇液，回收正丁醇至干，残渣加甲醇溶液溶解并定容至10ml,为供试品溶液。2.1.3 含量测定 精密量取对照品溶液0.4ml，供试品溶液0.4ml, 分别置具塞试管中，水浴挥干，冷却，加10%香草醛溶液0.5ml，加60%浓硫酸5ml2，摇匀，60水浴保温15min, 取出，冰水浴冷却，随行试剂做空白，在474nm波长处分别测定吸光度，计算含量。2.2 浸膏得率测定方法精密吸取样品液20 ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置于70真空干燥箱中干燥，至恒重后于干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算，即得。2.3 正交试验设计2.3.1 药材吸水率考察 称取干燥药材25g置于烧杯中，加一定量的足量水，等药材药材完全被浸透后，倒出多余水分，计算出吸水率，结果药材吸水率为150%。2.3.2 正交试验设计 表1 正交试验因素水平表因素水平A加水量（倍）B提取时间（h）C提取次数(次)1611281.52310232.3.3 正交试验及结果分析称取桔梗药材饮片27份，每份25.0g，按照L9(34)正交试验表进行试验，每组试验平行三次。各提取液均浓缩至50ml，按供试品制备方法和含量测定方法进行试验。正交试验结果见表2、表3，方差分析结果见表4、表5。表2 正交试验设计及浸膏得率结果因素试验号ABCD浸膏得率（%）1111139.923 2122254.002 3133358.199 4212358.011 5223159.325 6231244.145 7313258.185 8321344.096 9332152.578 Ij152.124156.118128.164 151.826 IIj161.481157.423 164.591 156.332 G=468.464IIIj154.859154.922 175.7091603.06CT=24384.2799R24399.711524385.3231 24796.620324396.2807 表3 浸膏得率方差分析结果方差来源离差平方和自由度均方值P溶剂用量 (A)15.431627.71581.2859提取时间(B)1.043120.52160.08689提取次数(C)412.34042206.170234.35940.05误差(D)12.000826.0004F0.01(2,2)99 F0.05(2,2)=19通过比较计算的F值与临界F值的大小，本实验所考察的三个因素（溶剂量、提取时间、提取次数）中其中提取次数具有显著性的差异。优选出的最佳方案为A1B1C3，即用6倍量水，提取时间为1h，提取次数为3次。表4 正交试验设计及桔梗总皂苷含量测定结果因素试验号ABCD含量（mg/g）111119.5734 2122213.7965 3133316.9400 4212313.39435223115.04556231210.35667313214.1140832139.88049332115.0455 IJ40.310037.081829.810439.6643 IIJ38.796438.722342.236338.2672IIIJ39.039942.342146.099540.2147R1551.38871555.77781599.24401551.6203表5 桔梗总皂苷含量方差分析结果方差来源离差平方和自由度均方值P溶剂用量 (A)0.440420.22020.6553提取时间(B)4.829522.41487.1873提取次数(C)48.2957224.147971.8736BA。即提取次数提取时间溶剂用量。结合出膏率与提取总皂苷含量，得最佳提取方案为A1B3C3，即用6倍量水，提取时间2小时，提取次数为3次。2.4验证试验为了考察所选择最佳工艺的稳定性，对其进行验证。称取桔梗3份，每份25g，按A1B3C3方案，即用6倍量水提取3次，每次2小时。提取液浓缩至50ml，取20ml，水浴蒸干，表6 验证试验结果编号浸膏得率（%）桔梗总皂苷含量（mg/g）159.06216.4955258.00216.5908358.07315.8922平均值58.37916.3262 由表6可以看出，该提取工艺稳定、可靠，达到提取优化的目的。3 讨论3.1 本试验结果提示，提取桔梗总皂苷宜采用少量溶媒，长时间、多次数的提取工艺。3. 2 考虑到第一次提取时药材对水会有所吸附，所以设计提取方案时第一次所加的水量把吸水率加了进去。3.3 本实验的方法学系采用本教研室以做的研究成果。并且在试验中发现，在测量吸光度时，冰水浴冷却后应快速测量，时间过长会对测量结果有较大影响。3.4 本法有操作简单、快速、生产成本低的优点，适合工业生产。 参考文献1 国家药典委员会，中国药典，I部S.2010：259-2602 李喜凤,薛秋萍,董诚明.桔梗中总皂苷的含量测定J.中医药学刊 2006 24（12）：2232-22343 郭文杰，许旭东，魏建和等.桔梗中三萜皂苷类化学研究进展J.中国药学杂志 2008，43（11）：801-8034 周永妍，程秀民，于海英.桔梗皂苷提取及质量控制新进展J. 中外医疗 2009 5：157-159 致 谢本文是在指导老师桂双英教授，王举涛老师和施伶俐师姐的悉心指导和热切关怀下完成的，瑾此对两位老师和师姐在学习、生活方面给予的指导和关怀表示衷心的感谢!在实验期间，中药药剂实验室的所有师兄师姐和同学给予我极大的帮助和支持，在此表示感谢!天然药化教研室也给予了极大的支持和帮助，在此谨表感谢。再一次对所有曾给予我支持、关心、帮助的老师和同学致以最衷心的谢意。感谢安徽中医学院药学院四年来对我的教育和培养。最后，祝愿各位老师工作顺利、身体健康、万事如意！综述 大孔吸附树脂在中药皂苷类成分中的应用摘 要：大孔吸附树脂是国内外新发展起来的处理技术。大孔吸附树脂是一种有机高聚物吸附剂， 具有很好的大孔网状结构和较大的比表面积， 可通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。近年来， 大孔吸附树脂广泛应用于天然药物的分离， 为分离有机化合物尤其是水溶性化合物的有效手段。本文根据近年来的相关文献,就其在近年来在中药皂苷分离研究中的应用作一综述。关键词：大孔吸附树脂；皂苷皂苷是广泛存在于自然界中的一类化合物，也是许多中草药发挥疗效的主要活性成分，那么皂苷的分离纯化就显得尤其重要。大孔吸附树脂分离技术是20 世纪60 年代发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术，近年来其应用于皂苷分离纯化的报道逐年增多，显示出良好的应用前景。在中药生产中既可除去大量杂质，又可使有效成分富集，同时完成除杂和浓缩两道工序，所以能缩小剂量，提高中药制剂的内在质量；应用大孔吸附树脂技术还可以减少产品的吸潮性，缩短生产周期，去除重金属污染等8。1. 大孔树脂的分离原理 大孔吸附树脂多为苯乙烯型或2-甲基丙烯酸配型，是一种没有可解离基团，具有大孔结构的固体高分子物质。其理化性质稳定，不溶于水、酸、碱及常用有机溶剂，显微形状为球形颗粒，颗粒内部有很多网状孔穴，因而具有很大的比表面积和很强的吸附能力。大孔吸附树脂是一种吸附原理和分子筛原理相结合的新的色谱方法，既能通过表面作用和形成氢键来产生吸附作用，同时其本身的多孔状结构又具有筛选作用。吸附和过筛作用以及本身的极性使得大孔吸附树脂具有吸附、富集、分离不同母核结构化合物的功能；可根据所分离化合物的性质选择树脂的孔径、比表面积和极性1。大孔吸附树脂具有选择性好、解吸容易、机械强度好、可反复使用和流体阻力小等优点，因此被广泛用于皂苷的分离纯化。2. 大孔树脂分离皂苷的可行性分析 皂苷是一类结构比较复杂的化合物，广泛存在于天然植物中，是螺甾烷及其相似来源的甾体化合物的低聚糖苷，以及三萜类化合物的低聚糖苷，可溶于水，其水溶液经摇动时能产生大量持久性类似于肥皂的泡沫，故名皂苷。皂苷由亲脂性的皂苷元和亲水的寡糖组成，按苷元的结构可分为两类：一类为甾体皂苷，结构中大多含有羟基，呈中性；另一类为三萜类皂苷，有羧基，呈酸性12。两类皂苷有一些共同的理化性质：一为皂苷的苷元的憎水性，能以疏水机理被非极性树脂所吸附；二为皂苷元连接糖基成苷后具有较大的极性，一般能溶于水或醇。因此皂苷可有多种分离方法，比如可通过正丁醇萃取而获得粗皂苷，但此传统工艺存在有机溶剂消耗多，萃取易乳化，糖和色素等杂质去除不完全等缺点。也有用甲醇或乙醇浸泡植物，回收溶剂后，将浸膏分散于水中，用石油醚脱脂后，再用乙酸乙酯萃取，然后水相用正丁醇萃取可得到总皂苷。而大孔吸附树脂吸附法则是较好的一种。因皂苷类成分多具有不同程度的疏水性功能基团而被大孔吸附树脂吸附，吸附作用随吸附对象的结构不同而有所差异；且易被有机溶剂洗脱，故皂苷类成分可用大孔吸附树脂吸附法分离1。3. 大孔树脂在皂苷中的应用3.1 大孔树脂在皂苷分离中的应用皂苷本身的特性和大孔吸附树脂分离纯化的优势决定了大孔吸附树脂技术能够在皂苷的分离纯化中得以推广发展。舒孝顺等9人研究了用大孔树脂分离分离菝葜总皂苷，确定了HPD100 型树脂对其具有良好的吸附性。分离纯化菝葜总皂苷具有良好的效果。克服了传统用正丁醇萃取操作过程的繁琐过程，且成本高，回收难，正丁醇难以除净等缺点。李志浩等10人对姜黄提取液用大孔树脂进行了分离纯化，解决了目前皂素生产主要采用自然发酵或直接酸水解法过程中废水排量大,污染严重等问题，为其工业化生产奠定了基础。马连荣等11人对番石榴叶提取液，进行了分离纯化，确定了其富集纯化番石榴叶皂苷的性能和洗脱参数。结果表明，番石榴叶总皂苷主要富集于30 %、50 %乙醇洗脱液部分，大孔吸附树脂的吸附容量为17.53 mgg - 1 ，洗脱率达70.42 % ，而50 %乙醇洗脱时总皂苷纯度可达55.68 % ，优选洗脱条件为用水洗去水溶性杂质，50 %乙醇洗脱总皂苷。刘宏群等18人采用D101 大孔吸附树脂柱、中压柱层析等方法成功分离制备了人参皂苷Ro。吴博等19人采用大孔树脂、硅胶、聚酰胺、ODS和Sephadex LH220 柱色谱方法对土茯苓化学成分分离,得九个化合物，经鉴定分别为-谷甾醇棕榈酸酯(-sitosterol palmitate, 1)、-谷甾醇(-s itosterol， 2) 、胡萝卜苷( daucos terol, 3) 、1-棕榈酰基-3-O -D 2半乳糖基甘油酯( 1-O hexadecanoyl-3-O -D -ga lac top yranosyl-glyce rol， 4) 、落新妇苷( as tilbin, 5) 、槲皮素( que rce tin, 6) 、花旗松素( taxilfolin, 7) 、槲皮素24- O -D -吡喃葡萄糖苷( que rce tin-4- O -D 2pyranglucoside, 8) 、异落新妇苷( isoastilbin, 9)，从而为土茯苓药材的质量控制提供了科学可靠的依据。张冰等22人对三七花蕾的化学成分进行研究利用体积分数为75%提取、D101大孔吸附树脂柱、硅胶柱、Sephadex LH220柱色谱等方法分离纯化，得到6个化合物,分别鉴定为:山奈酚-3-O-D-半乳糖(21)葡萄糖苷( kaempferol 3-O-( 2- -D-galactopyranosyl) -D-glucopyranoside, 1) 、槲皮素-3-O -D -半乳糖(21)葡萄糖苷( que rcetin 3-O-( 2- -D -ga lac topyranosyl) -D -glucopyranos ide,2) 、鸟嘌呤核苷( guanos ine, 3) 、腺嘌呤核苷( adenosine, 4) 、-谷甾醇(-s itos terol, 5) 、胡萝卜苷( daucos terol, 6) 。其中化合物1、2为首次从该植物花蕾中分离得到,化合物3、4为首次从该植物中分离得到。李志浩等20人用D - 101 树脂分离纯化了黄姜中薯蓣皂苷。其参数为：其动态饱和吸附量达到151. 7 mgg - 1 干树脂,其最佳工艺为以6 倍柱体积去离子水、6 倍柱体积60 %乙醇一次洗脱,薯蓣皂苷转移率为95 %。3.2 大孔树脂在皂苷分析中的应用使用大孔吸附树脂在适当的条件下进行预处理，能有效除去某些干扰成分，再结合其它检测手段，使测定变得准确、快速，对控制中药材或中药制剂的质量具有很好的实用价值。如沈岚等13人对三七总皂苷含量测定建立了一种测量方：将药材加入索氏提取器中，氯仿回流。再石油醚提取，水液通过大孔吸附树脂柱洗脱，以水50 mL洗脱，弃去水液，再用20 乙醇50 mL洗脱，弃去20 ml乙醇洗脱液，继用乙醇80 mL洗脱,收集洗脱液70 mL，蒸干。定容，用香兰素-冰醋酸-高氯酸显色。回收率为100.6%，RSD为3.30。方法科学，结果可靠。再如：刘宏群等14人。采用D101 大孔吸附树脂柱、中压柱层析等方法分离制备人参皂苷Ro，HPLC 法测定人参皂苷Ro 的含量，LC/MS分析结果。此方法效果较好，简单快速。李韶英等15人在建立黄芪健胃膏中芍药苷的含量测定方法时，对比了用大孔树脂和不过大孔树脂做了比较，用HPLC进行含量检测，对同一色谱柱，不过大孔树脂的供试品拖尾因子偏大( 1.05)，而过大孔树脂柱所制备的供试液，测定中拖尾因子符合要求(0. 951. 05) 。从而优化了黄芪健胃膏中芍药苷的含量测定方法。蒋启明等16人用HPLC 法测定咽炎胶囊中黄芩苷的含量时，将其提取液用DA - 201 型大孔树脂分离纯化，其它成分对黄芩苷的含量测定无影响，测定效果好。为咽炎胶囊的质量控制提供了简单，准确的方法。谢寅鹤等21人通过研究进一步完善了柴黄片的质量标准，柴胡皂苷是柴胡中的主要活性物质，也是柴黄片发挥药效的主要成分， 由于柴黄片中其它成分对含量测定的干扰，无法直接用比色法对其皂苷类成分进行测定, 经过试验发现采用氨性甲醇超声提取, 大孔吸附树脂富集，可有效地去除测定干扰，有利于含量测定。从而为进一步完善其质量标准提供了科学依据。 4 影响大孔树脂吸附、分离的因素4.1 树脂的型号与性质大孔树脂的吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性功能基和空间结构孔径、比表面积、孔容，可参考相似相吸原理选择，即一般非极性化合物在水中可以为非极性树脂吸附，极性树脂则易在水中吸附极性物质。孔径的大小直接影响不同大小的分子自由出入，从而使树脂具有选择性。因此，只有当孔径对于吸附质足够大时，比表面积才能充分发挥作用。孔径合适，吸附量随比表面积的增大而增大。大孔树脂根据孔径、比表面积及构成类型被分为许多型号， 在应用中可根据实际要求加以选择2。用大孔吸附树脂对白簕叶总皂苷的纯化工艺研究中以白簕叶总皂苷产率为评价指标，考察静态吸附量和解吸率筛选出最适型号树脂，结果AB-8型树脂为纯化白簕叶总皂苷的最佳树脂型号3。顾维等17人用大孔树脂纯化薤白总皂苷时考察了D101、 AB-8、 NAF-9、 HPD-100 、HPD-600对薤白总皂苷的吸附性能，D101、AB-8、HPD-100均有较大的吸附容量,在解吸附试验中， D101树脂的解吸量和解吸率均是最高，故确定使用D101树脂分离纯化薤白总皂苷。4.2 洗脱剂种类及浓 度常见的洗脱剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等, 在实际工作中, 乙醇应用较多。可根据吸附力强弱选用不同的洗脱剂及浓度。对于非极性树脂, 洗脱剂极性越小, 其洗脱能力越强对于中极性和极性树脂, 则用极性较大的洗脱剂为宜。为了达到满意的效果, 可设几种不同浓度的洗脱剂洗脱, 以确定最佳的洗脱剂浓度。如, 用不同浓度的乙醇洗脱液对白簕叶进行纯化研究，结果发现浓度为70%时为最佳洗脱浓度3。针对不情况，也可梯度洗脱，如，周萍等人用大孔树脂富集枸骨叶的总皂苷的研究中，先用蒸馏水，和低浓度乙醇洗脱脂溶性杂质，最后用70%浓度乙醇洗脱总皂苷4。4.3 上样溶液浓度 若上样液较稀， 则上样液粘度较小，在一定上样流速下溶液通过柱床流速较快，大于传质速度， 传质未进行彻底即可能泄露。若上样液太浓，则粘度较大, 被吸附物质往树脂内部扩散传质速度变慢，而且树脂周围的被吸附物质分子过多, 都使得某些没来得及被吸附就流出来，两种情况均不能达到最大吸附量2。王光忠等人用大孔树脂纯化盾叶薯蓣总皂苷的工艺研究中考察了上样浓度，用蒸馏水把提取液释至浓度为0.1 ,0.25 ,0.5 ,0.75 ,1.0 gmL- 1 的溶液后上大孔树脂柱,洗脱后，测吸光度，结果 浓度在0.25-0.5g/ml时，总皂苷含量基本一致，综合考虑，采用0.5g/ml的上样浓度5。4.4 上样液ph值提取液的ph值是影响树脂纯化效果的重要因素，其基本原理是中药有效成分在不同ph值条件下溶解性能不同，因而易于吸附或解吸附。一般而言，酸性化合物在酸性溶液中进行吸附，碱性化合物在碱性溶液中进行吸附较为合适，中性化合物可在近中性的情况下被吸附。高侠等3人在大孔吸附树脂对白簕叶总皂苷的纯化工艺研究中，把上样液配成不同ph进行上样，考察其吸附率，pH值呈酸性时，大孔树脂对白簕叶总皂苷的选择吸附性能好。Ph 值5-6时为最佳。4.5 吸附流速 对于同一浓度的上样溶液，吸附流速过大，树脂的吸附量就会下降，吸附流速过小，吸附时间就会增加。在实际应用时，应综合考虑来确定最佳吸附流速,既要使树脂的吸附效果好，又要保证较高的工作效率。例如：李跃辉等6人用大孔树脂纯化甘草总皂苷的研究中当把提取液ph调为7.0时以2 BVh - 1 的流速上样于D2101 大孔吸附树脂柱，效果较好，当把提取液ph调为8.0-9.0的乙醇溶液时以2 BVh - 1的速度洗脱,收集4 BV 的洗脱液洗脱效果较好。4.6 洗脱剂的用量洗脱剂用量过小将使被吸附成分不能被洗脱完全，过大则浪费试剂和时间并给洗脱液的进一步浓缩提取造成困难。在实验中可以用洗脱率等指标考察确定最佳用量。如：赵丽等7人用打孔树脂纯化五鹤续断总皂苷考察了洗脱剂用量，洗脱剂为50%乙醇，洗脱剂用量为5倍量树脂柱床体积，得总皂苷回收率91%。效果较好。展望应用大孔树脂提取中药成分，特别是在皂苷分离纯化应用方面，工艺简单，产品纯度高，树脂处理方便且可再生后使用，降低了工艺成本。皂苷本身的特性和大孔吸附树脂分离纯化的优势决定了大孔吸附树脂技术能够在皂苷的分离纯化中得以推广发展，成为代替溶剂法用于皂苷工业化生产的一种有效方法。大孔吸附树脂应用于皂特别是复方总皂苷的分离纯化还存在一些问题。总之，大孔树脂在中药皂苷分离纯化方面的应用中显示了独特的优越性，应广为研究，加以推广。 参考文献1 黄鹤洁.大孔吸附树脂在分离提取中药皂苷有效部位中的应用J.亚太传统医药,2009,5(6).2 周忻.大孔吸附树脂分离纯化中药有效成分的影响因素J.中药专题,2006 ,2:50-53.3 高侠,黎云祥，蔡凌云,等.大孔吸附树脂对白簕叶总皂苷的纯化工艺研究J 中药材， 2009 ,5（32）:780-782.4 周萍,廖庆