《节克隆技术》PPT课件.ppt

第二章 克隆技术,每种生物都能够产生本物种的后代。,种类,无性繁殖,有性繁殖,繁殖,1.草履虫、变形虫的分裂生殖,2.根 霉、青 霉的孢子生殖,3.水 螅、酵母菌的出芽生殖,4.草 莓、马铃薯的营养生殖:嫁接、扦插,保持亲本的遗传性状,更大的生活力和变异性,一、无性繁殖与克隆,只要不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合，只由一个模板分子、母细胞或母本直接形成新一代分子、细胞或个体，就是无性繁殖，即克隆。,克隆定义包含了三个层面上的含义。 1、分子水平 2、细胞水平 3、个体水平,无性繁殖系：个体通过无性繁殖可连续传代形成的群体，克隆就是指无性繁殖系。,分子水平,克隆技术是指某种目的基因的复制、分离过程。,个体水平,克隆技术就是指一种通过单个细胞，特别是来自特定个体 的单个细胞进行无性繁殖，从而产生新个体的过程。,克隆技术定义的层次：,细胞水平,基因克隆,克隆技术是指从众多的细胞群体中通过无性繁殖 和选择获得特定类型细胞的技术操作。,如：PCR技术,细胞系的培养,如：制备单克隆抗体,如：植物组织培养技术、 克隆羊“多莉”的产生,繁殖出生物个体,克隆概念的发展（三个水平）,1、在分子水平上 2、在细胞水平上 3、在个体水平上,重组载体通过宿主细胞的无性繁殖使目的基因扩增，再用某探针选取、钓取目的基因。,单克隆抗体：利用动物细胞融合技术将骨髓瘤细胞和能产生抗体的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，再去培养，筛选到杂交瘤细胞系。,基因克隆,细胞系的培养（制备单克隆抗体）,繁殖出生物个体,二、克隆技术的发展：,微生物克隆时期 遗传工程克隆时期 个体水平上的克隆时期,DNA克隆或基因克隆,植物克隆、动物克隆,细胞克隆,克隆技术的发展,、微生物克隆（无限潜能，有限条件）,用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群。,克隆技术的发展,、遗传工程克隆 （重组，转化，扩增）,在科学发展过程中基因工程技术出现较晚。,克隆技术的发展,、个体水平上的克隆（最早的克隆概念）,(1) 动物胚胎细胞克隆个体,(2)植物体细胞克隆个体,是指用胚胎细胞核移植的方法，以克隆出新的个体。该技术以胚胎细胞作为供体提供细胞核，移植到准备好的去核卵细胞,让该卵母细胞质和导人的胚胎细胞核融合、分裂、发育为胚胎。把该胚胎移植入一只动物的子宫，让其妊娠产仔。是动物克隆技术的主要方法之一。,克隆动物就是不经过生殖细胞的结合（受精）而直接由体细胞获得新的个体。因此，现在的克隆动物不属于严格意义上的动物个体克隆。,动物克隆：由胚胎细胞克隆到体细胞克隆的发展过程,克隆动物就是不经过生殖细胞的结合（受精）而直接由体细胞获得新的个体。因此，现在的克隆动物不属于严格意义上的动物个体克隆。,三、 克隆的条件,1、理论条件 2、基本条件,具有包含物种完整基因组的细胞核的活性细胞； 能有效调控细胞核发育的细胞质物质； 完成胚胎发育的必要的环境条件。,细胞(主要是包含遗传物质的细胞核)具有的发育全能性。,第二节 植物克隆,1958年美国科学家斯图尔德,愈伤组织,离体组织,胚状体,试管苗,植物克隆的技术基础是-， 理论基础是-,植物细胞的全能性,植物组织培养,2:植物克隆的理论基础,植物细胞的全能性(掌握),植物体的每个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。,植物体的每个活细胞具有遗传上的全能性,都具有发育为完整植株的潜能，这种潜能植物细胞的全能性。,1、概念,2、原因,思考：1、用作克隆培养的活细胞的细胞核中，至少需要几个完整的基因组？,（一个，如雄蜂、雄蚁、二倍体的花粉离体培养）,思考：2、是不是所有生物的细胞都能发育成完整的个体呢？,2:植物克隆的理论基础,1、概念,2、原因,3、全能性的体现：,植物细胞 动物细胞,不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间因遗传性的差异,细胞全能性的表达程度大不相同.,分化程度低的细胞分化程度高的细胞,P23,植物细胞的全能性(掌握),思考：3、不同种类、不同个体的植物细胞全能性相同吗？,有些植物在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力（P23）,原因：1.遗传物质发生不可逆转的改变 2.生长发育条件的改变,克隆成功所需的条件（掌握） 1.深入探讨特定植物细胞全能性表达的条件 2.选择性状优良、细胞全能性表达充分的基因型,染色体畸变、细胞核变异、非整倍体的产生,激素平衡被打破、对外源生长物质的敏感性发生改变、其他原因产生了缺乏成胚性的细胞系,思考：4、植物细胞在什么条件下能培养成一个完整的植株？,4、植物细胞可能表现出全能性条件（掌握） ：,其他外界条件,（适宜温度、无菌、光照（后期）,2:植物克隆的理论基础,思考：5、植物细胞培养成一个完整的植株的过程？,思考讨论：为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？这体现了生物学中的一个什么学科思想？,基因在特定空间和时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。,局部和整体思想,、配置固体(半固体)培养基 、无菌操作获取植物组织 、接种、脱分化获得愈伤组织 、诱导愈伤组织再分化，再生新植株,成分？,2:植物组织培养的程序（掌握）,愈伤组织的形态发生方式有不定芽方式和胚状体方式两种。P22,植物组织培养的培养基,定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质 无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素 有机营养成分 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%5%的蔗糖（提供能量，维持渗透压） 琼脂：凝固培养基的作用 激素：生长素，细胞分裂素 PH值：5.06.0,一、培养基的配制,实验操作P60-61,3、培养基配制程序 （1）配制培养液；（2）熔化琼脂；（3）调pH值；（4）培养基分装；（5）高压灭菌。,1、母液的配制和保存: MS培养基母液、萘乙酸母液、 苄基腺嘌呤母液,2、,发芽培养基,生根培养基,脱分化,愈伤组织：相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织,再分化,调节营养物质和生长调节剂的适当配比（P24）,诱导根、芽顶端分生组织,2:植物组织培养的程序（掌握）,不定芽方式,高(细胞分裂素浓度相对大) 诱导芽的生成 1左右(浓度相近) 愈伤组织生长而不分化 低(生长素浓度相对大) 有利于根的形成,植物组织培养条件植物激素,植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。,发芽培养基,生根培养基,培养基,注意：在植物组织培养过程中要先进行生芽培养，再进行生根培养，,植物组织培养条件植物激素,植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。,激素配比模式,有利于根的形成,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向。,细胞分裂素/生长素,发芽培养基,生根培养基,高(细胞分裂素浓度相对大),1左右(浓度相近),低(生长素浓度相对大),诱导芽的生成,愈伤组织生长而不分化,离体的植物器官或组织或细胞（外植体）,愈伤组织,细胞分裂和脱分化,根、芽,植物幼体,继续发育,一棵完整的植株,细胞分裂和再分化,需要适宜的环境条件,植物激素： 细胞分裂素、生长素等,一定的营养物质和植物生长调节剂、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。,(不需光),(需光),2:植物组织培养的程序（掌握）,不定芽方式,光照问题:,愈伤组织细胞中有叶绿体吗？,对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。 但诱导形成愈伤组织阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。 由愈伤组织经细胞有丝分裂和分化形成试管苗的过程中需要光照，原因是叶中叶绿素的合成需要光照条件 ，实现由异养自养的转变。,2:植物组织培养的程序（掌握）,脱分化,通过悬浮培养分散成单细胞,细胞质丰富、液泡小而细胞核大（胚性细胞的特征）,再分化,调节营养物质和生长调节剂的适当配比,包裹人工种皮，形成人工种子,胚状体,2:植物组织培养的程序（掌握）,胚状体方式,在组织培养从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构,离体的植物器官或组织或细胞（外植体）,愈伤组织,细胞分裂和脱分化,胚状体,植物幼体,继续发育,（单细胞）,一棵完整的植株,细胞分裂和再分化,包以人工种皮， 形成人工种子,通过悬浮培养分散成,植物激素： 细胞分裂素、生长素等,2:植物组织培养的程序（掌握）,胚状体方式,优点：数量多 速度快 成苗率高,细胞团、球形胚、心形胚,2:植物组织培养中的核心概念,是将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚(成熟和未成熟的胚)、胚乳、原生质体，在无菌条件下培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、胚状体或不定芽等，再长成完整的植株，统称为植物组织培养。 根据外植体来源和培养对象的不同，又分为器官培养、组织培养、胚培养、原生质体培养等。,植物组织培养:,2:植物组织培养中的核心概念,愈伤组织：,胡萝卜的愈伤组织,细胞排列疏松而无规则，是相对未分化的薄壁细胞群。,脱分化 ：,由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。,实质是指已经分化的细胞失去其特有的结构和功能变成具有未分化细胞（胚性细胞）特征的过程。,2:植物组织培养中的核心概念,再分化:,脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。,实质是指已去分化的胚性细胞在某种诱导因素的激活下，再出现程序化的分化。,用于化合物的工业化生产,植物组织培养技术在 科学研究和生产实践 上具有多方面的用途,用于器官分化、形态建成、物质代谢以及细胞遗传、病毒学等方面的研究。,用于快速繁殖,用于培养无病毒植株,用于改良植物品种,培养物质低温贮藏和种质库的建立,11.为保持某观赏植物优良的遗传性状，某科技小组利用植物组织培养技术来进行繁殖。他们将该植物的花芽分别培养在含有不同比例的吲哚乙酸和细胞分裂素的培养基中，得到的花芽生长状况如下表：,BCD,细胞分裂素的浓度大于吲哚乙酸的浓度,恰当调控好培养基中细胞分裂素与吲哚乙酸的浓度和它们的比例,在此过程中能实现脱分化的花芽有 组。 从实验结果可看出：吲哚乙酸和细胞分裂素是实验中的二种重要物质。 其中，新芽形成必须的条件是_ 而在培养形成完整新个体过程中的不同培养期，对它们的调控关键是 。,（1）在生产前，需先加入紫草细胞作为反应器中的“种子”。这些“种子”是应用组织培养技术，将紫草叶肉细胞经过_而获得的。这项技术的理论基础是_。 （2）从图中可以看出：反应器中紫草细胞的生长呈现_规律；影响紫草素产量的因素是_和_。 （3）在培养过程中，要不断通入无菌空气并进行搅拌的目的_和_。,脱分化,细胞的全能性,S型增长,细胞数量,细胞所处的生长期,保证氧气供应充足,使细胞与培养液充分接触,12. 紫草素是紫草细胞的代谢产物，可作为生产治疗烫伤药物的原料。用组织培养技术可以在生物反应器中通过培养紫草细胞生产紫草素。下图记录了生物反应器中紫草细胞产量、紫草素产量随培养时间发生的变化。,下图是植物组织培养的简略表示。据此回答： （1）表示 ，它能被培养成为的 根本原因是 。体现植物细胞全能性的是 过 程。 （2）表示 ，它与相比分化程度 ，全能性 。 （3）若想制作人工种子，应该选用（填编号） 。 （4）若是花药，则是 ，继续对其使用 处 理可获得 正常植株，该过程称为 。 （5）若是胡萝卜根尖细胞，则培养成的的叶片的颜色是 ， 这说明根尖细胞 。,离体的器官、组织或细胞,植物细胞的全能性,愈伤组织,低,高,单倍体植株,秋水仙素,纯合,单倍体育种,绿色,含有叶绿体形成相关的基因,再分化,愈伤组织细胞芽和根的分生组织完整植株,愈伤组织细胞单细胞细胞团球形胚心形胚胚状体完整植株,2:细胞培养和器官培养方法(掌握),愈伤组织器官（如风信子）,如何实现上述器官发生和形态建成呢？,平衡的植物激素,1、适量的_和 配比可以诱导_的分化。,细胞分裂素,2、适量的 _及适当减除其他某些激素，则可以诱导生_。,根,芽,激动素,吲哚乙酸,2:细胞培养和器官培养方法(掌握),、可以在实验室环境进行植物受精过程和植物胚胎发育过程，以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究； 、可以进行遗传工程的操作，完成与植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究； 、可以通过实验手段培育植物新品种。,2:细胞培养和器官培养的意义(掌握),白菜风味较佳，易于种植，北方的冬天蔬菜主要以吃储存的白菜为主，但储存久了，通常会出现大面积腐烂的现象。,甘蓝风味较差，但是具有极耐储存的优点,如何集两者的优点于一体？,原生质体：细胞中有代谢活性的原生质部分，包括细胞膜、细胞质和细胞核。(P22),如何剥离细胞壁呢？,用纤维素酶和果胶酶啊！,2:原生质体培养（掌握）,为什么要加较高渗透压的甘露醇呢?,植物原生质体的培养：,植物 细胞,0.50.6mol/L的甘露醇 (较高渗透压),纤维素酶、果胶酶,球形的 原生质体,愈伤组织,胚状体,植株,思考:原生质体培养成功有何生物带动意义？,防止原生质体吸水胀破,2:原生质体培养的过程,植物原生质体的特点：,2:原生质体培养的过程,比较容易摄取外来的遗传物质，如 便于进行细胞融合，形成杂交细胞 与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株,所以在原生质体培养成功后，植物体细胞杂交和基因工程技术等细胞工程技术得以快速发展,2:植物体细胞杂交概念、方法(掌握)P26,将连个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物的方法。,1、概念,2、方法,物理：电刺激,化学：聚乙二醇,3、优点,克服植物远缘杂交不亲和的障碍,去壁，融合（物理、化学），组织培养,注意：体细胞杂交=细胞融合+组织培养,4、应用,白菜甘蓝、烟草海岛烟草、烟草与大豆、烟草与天仙子、矮牵牛与番茄,思考：1、白菜、甘蓝体细胞融合后的为几倍体？ 2、如取两者的花粉进行融合后，获得的植物是否可育？,培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体）中或通过细胞融合、显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。,转基因植物细胞或重组细胞,具有特定性状新植株,2:植物细胞工程的概念、方法(掌握),植物细胞工程的应用P24,2:植物细胞培养主要几种技术：,1、组织培养 2、悬浮细胞培养 3、原生质体培养 4、单倍体培养,通过调节营养物质和生长调节剂的适当配比，诱导愈伤组织生芽生根而形成再生新的植株。,通过液体悬浮培养使愈伤组织分散成单细胞，经适宜培养基中成分的诱导，可发育成胚状体，从而形成新株。,原生质体：去除细胞壁后的植物细胞。,用适当方法进行原生质体培养，也可以获得新植株。,用花药离体培养方法获得单倍体植株。,小结,植物克隆,个体水平,理论基础,技术基础,植物细胞全能性,植物组织培养技术,概念、原因、全能性高低体现,丧失全能性的原因,克隆成功所需的条件,可能表现出全能性的条件,概念、程序,愈伤组织形态发生的两种方式,应用,植物克隆的成绩,细胞水平,植物细胞培养的主要几种技术,器官水平,器官培养的方法,原生质体培养,植物细胞工程,植物体细胞杂交,转基因植物,多途径上的植物克隆实践,讨论：1.植物克隆的三个层次：,（1）细胞：愈伤组织细胞悬浮培养成细胞系,（2）器官：愈伤组织直接发育出花器官；子房的培 养、胚囊的培养,（3）个体：愈伤组织细胞悬浮培养的单细胞细胞团球形胚心形胚胚状体完整植株,2.以基因型为AaBb水稻的体细胞和花粉离体培养为例，说明为单倍体育种的生殖类型？,无性生殖的特点是子代保持亲代的性状，AaBb水稻的体细胞培养，子代的基因型和表现型与亲代一致，AaBb水稻的花粉的基因型有四种：AB、Ab、aB、ab，表现型也不同。,1 .下列关于植物克隆的叙述，不正确的是（ ） A .利用植物组织培养技术可以实现细胞水平和个体水 平的克隆，也可以实现器官水平的克隆。 B .长期培养中，培养物器官形成能力下降的原因是基 因突变 C .调节营养物和生长调节剂的适当配比可影响愈伤组 织的分化 D .胚性细胞的特点是细胞质丰富、液泡小而细胞核大,B,2:课堂练习,2 .基因型为AaBb的水稻（含24条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，下列说法中，不正确的是 ( ) A .要促进花粉细胞分裂、生长，培养基中应有一定浓度的生长素等植物激素 B .试管苗的培育经过了脱分化和再分化，没有经过减数分裂，所以是无性生殖 C .花药离体培养出试管苗的原理之一是植物细胞的全能性 D .培育成的试管苗可能出现的基因型有AB、Ab、aB、ab，是单倍体,B,3.下列四个选项中，没有采用植物组织培养技术的一项是 ( ) A花药离体培养得到单倍体植株 B. 秋水仙素处理萌发的种子或幼苗得到多倍体植株 C基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株 D大量生产紫草中治疗烫伤的成分紫草素 4.在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需要的（ ） A消毒灭菌 B适宜的温度 C充足的光照 D适宜的养料和激素,B,C,5.某组织培养实验室的愈伤组织被真菌严重污染，为查找污染原因设计了4个实验，实验条件除图示外其他均相同。下列各图表示实验结果，据图可得出的初步结论是 ( 多项 )（ ）,A污染主要不是培养基灭菌时间短造成的 B污染主要来源于组织培养所用的离体组织 C调节培养基pH不能解决污染问题 D调节培养温度不能解决污染问题,ABCD,7.下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（ ） A培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同,