应化第12章 分子发光-荧光与磷光.ppt

仪器分析课程,第十二章,Chapter Twelve,分子荧光:Fluorescence 分子磷光:Phosphorescence,分子发光-荧光、磷光,12.1 概 述 什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是荧光现象，它发出的光就叫荧光。 分子发光分析法是基于被测物质的基态原子吸收能量被激发到较高电子能态后。返回到基态过程中，以发射辐射的方式释放能量，通过测量辐射光的强度对被测物质进行能量测定的一类分析方法。,夜明珠发光成因 1、矿物的发光性 矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。 外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。 根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。 2、矿物的发光机理 矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态 （非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。,荧光的发现,1575：N.Monardes Lignum Nephriticum,1852：Stokes 植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁 借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光 Fluorescence 1867年：Goppelsroder 进行了历史上首次的荧光分析工作 应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定,1880：Liebeman 提出“荧光与化学结构关系”的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕,19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。,1.激 发 通常在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级。当电子吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升至不同激发态的各振动能级，其中大部分分子上升至第一激发单重态（ S1 ），这一过程称为激发。,一. 分子荧光与磷光的产生,12.2 分子发光的基本原理,2.去活化过程 处于激发态的分子是不稳定，它可以通过 不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程有以下几种： （1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很 多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶 剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最 低振动能级，这一过程称为振动驰豫。,（2）内转换 同一多重态的不同电子能级间可能发生内部转换。 S2 S1 条件：当S2较低振动能级与S1较高振动能级的能量相当，且发生重叠时分子才有可能S2 S1,（3）荧光发射 处于第一激发的最低振动能级的分子，跃迁回基态的各振动能级，这一过程称为荧光发射。,（4）系间窜越 分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称系间窜越跃迁。,（5）外转换 溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的方式释放。,荧光的产生,当一些物质被光照射后，物质的分子吸收光以后，便以基态跃迁到激发态， 当电子由激发态的最低振动能级S1跃迁回基态S0的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。,二、荧光发生机理,荧光寿命: 109107 s,荧光寿命: 109107 s,三. 分子荧光(磷光)光谱,1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱,荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。,A. 激发光谱,固定em=620nm(MAX),ex =290nm (MAX),固定发射波长 扫描激发波长,荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似,C. 激发光谱与发射光谱的镜像关系,B. 发射光谱(荧光光谱),固定激发波长 扫描发射波长,1.任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激发光谱和发射光谱 2.斯托克斯位移：与激发光谱相比，荧光光谱的波谱总是出现在更长的波长处 3.荧光光谱形状与激发波长无关 4.镜像规则： 激发光谱和发射光谱 有很好的镜像关系,三、荧光光谱的特性, 激发光谱 发射光谱,2. 三维荧光光谱,I F f (ex 、em),蒽的激发光谱,固定发射波长、扫描激发波长,I F f (ex 、em),蒽的发射光谱,固定激发波长、扫描发射波长,VB1和VB2的三维荧光光谱,四. 荧光(磷光)的量子产率,荧光量子产率的定义：,kF主要取决与荧光物质的分子结构； ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。,大多数的荧光物质的量子产率在0.11之间； 例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1,共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。,刚性平面结构,芴,联苯,F=1,F=0.2,五、荧光与分子结构的关系,不产生荧光,产生荧光,产生荧光,不产生荧光,F=0.92,萘,VA,F(萘)= 5F(VA),荧光黄,酚酞,偶氮菲,偶氮苯,1）给电子取代剂加强荧光,取代基效应,HN2， NHR ， NR2， OH， OR ， CN,产生 p 共轭,二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 T1的系间窜跃产率接近1,2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光,C=0， COOH ， NO2,不产生 p 共轭,硝基苯：不产生荧光、弱磷光,空间位阻对荧光发射的影响,3）取代基的位置,反式二苯乙烯 强荧光物质,F=0.75,F=0.03,立体异构体对荧光发射的影响,顺式二苯乙烯 非荧光物质,电离效应对荧光发射的影响,pH=1, 有荧光,pH=13, 无荧光,无荧光,有荧光,荧光与分子结构的关系小结,（1）发光分子中要具有共轭键体系 共轭的程度越大，电子越容易激发，分子荧光越容易产生。 （2）具有刚性平面结构 分子有利于荧光发射,（3）取代基效应 给电子基增强荧光（OH, NH2,NHR,NR2,CN）；吸电子基减弱荧光（Br , Cl , NO2, NN, COOH）,四、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure,影响荧光强度的外部因素 1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化； 2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。 3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,4.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,5.溶液荧光的猝灭,碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。,六、定量分析的原理 （1）荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系,在稀溶液中： F2.3Kb cI0 荧光物质的荧光效率(量子产率)： c-荧光物质浓度 摩尔吸光系数 b液层厚度 I0入射光强度 K检测效率（由仪器决定）,当b，I0一定时： F Kc,一般当b c 0.05 时, F 与c呈线性关系,高浓度时，荧光物质发生自熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系,c,（2）环境对荧光强度的影响 relation between fluorescence and molecular structure,影响荧光强度的外部因素 1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化； 2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。 3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。,4. 各种散射光的影响 溶剂产生的散射光，因为荧光发射波长跟激发光波长无关，可通过改变后者来避免散射光的干扰。 5. 激发光照射的影响 能使荧光强度降低。最好采用强度低的激发光，缩短测定时间，减小荧光物质分解引起的测量误差。,6.溶液荧光的猝灭（quenching）,碰撞猝灭； 配合物或电子转移猝灭等。,12.3 荧光(磷光)分光光度计,一. 主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理 仪器控制,发射单色器,仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。,二. 光源,1. 光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命,2.氙灯光源,常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源,波长范围：2001000nm 工作压力：520 atm 启动电压：2040KV 使用寿命：10002000h,最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大,1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样,2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光,问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？,紫外-可见分光光度计:,荧光(磷光)分光光度计:,紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池),荧光分光光度计 样品池,I0,It,I0,It,IF,p,可获得三维光谱图的仪器,可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图,磷光检测,荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。,测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。,12. 荧光分析方法与应用,1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？ （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。,（2）定量方法,标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；,标准 工作曲线法,直接荧光标准曲线法,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。,三. 荧光分析的应用,1. 无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10;,某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。 较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W,荧光熄灭测定法,自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。,催化荧光测定法,较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb,某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。,低温荧光测定法,常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN,某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。,溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 1960C,较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素 Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn,固体荧光测定法,固体荧光发在荧光分析中也经常用到。,芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。,. 有机化合物,3. 生命与生物物质,用于活体检测的荧光探针,三、磷光分析法的应用,1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质） 2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.药物分析和临床分析,一、基本原理 principle 二、化学发光分析的特点 characteristics 三 装置与技术 instrument and technology,第三节 化学发光分析法,chemiluminescence analysis,一、基本原理 principle,1. 化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,气相化学发光： 乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O* CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1g/cm-3；,液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼） 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可