细胞工程》第6章：细胞拆合与克隆技术.ppt

Chapter 6、细胞拆合与克隆技术,61 细胞拆合 611 细胞拆合技术发展概况 612 细胞拆合概念与意义 613 细胞拆合技术与关键 62 克隆技术 621 克隆的定义及理论基础 622 细胞核移植（也是克隆技术关键） 623 克隆动物一般制备技术 624 体细胞克隆技术 625 克隆技术的应用与意义 626 存在的问题 627 克隆技术发展趋势,61 细胞拆合,611 细胞拆合技术发展概况,612 细胞拆合概念与意义,一、细胞拆合（Cell Reconstruction）： 是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组 分，在体外一定条件下将不同细胞来源的 细胞器及其组分进行重组形成有生物活性 的细胞或细胞器的一种细胞工程技术。,二、细胞拆合过程： 细胞器及其分离 同种或异种细胞器与 组分重组 新的重组细胞或新的性状或产品 细胞核分离、 细胞核 胞质体的获得 融合 胞质体,三、细胞拆合基本方式（目前）,四、细胞拆合意义,细胞拆合技术是现代生物工程中令人 瞩目的热点课题，细胞拆合与细胞融合 技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平 上主要构建手段，它与基因转移技术、 干细胞技术等结合，可以人为地获得新 物种或使细胞表达新的性状和新的产物。,613 细胞拆合技术与关键,一、细胞拆合技术方法 细胞组分分离技术 分级分离法 细胞大小、密度 密度梯度离心法 利用 细胞表面电荷 流式细胞分选仪分离法 细胞表面标志,细胞破碎方法,超声波破碎法 反复冻融法：-70 37C，重复3-4次， 细胞壁破碎 化学裂解法：SDS（十二烷基磺酸钠） 高速组织捣碎法：需循环水冷却,流式细胞分选仪,去核细胞（胞质体）的制备：（见罗立新表5-1）,核体的制备： 贴壁法纯化（见图5-2、5-3） 核体需5-10h再贴壁 培养 分离 完整细胞需2h （菲可液梯度离心）,微核体的制备： CB具有排核作用，形成的微核体； 01ug/mL秋水仙胺，48h，处理细胞 细胞微核化 离心14000r/min、20min， 80-90% 1-3%牛血清密度梯度离心 （见图5-4）, 去核细胞的性质：,二、细胞拆合技术关键,细胞器与完整细胞融合： ctDNA叶绿体 （抗药性、色素） 细胞器分离 细胞器包裹 mtDNA线粒体 形成脂质体或血影细胞 与完整细胞融合 生物大分子引入完整细胞： 1975年，童第周、牛满江，鲤鱼或鲫鱼mRNA 鲤金鱼 金鱼受精卵 鲫金鱼,62克隆技术,621 克隆的定义及理论基础 一、克隆（clone）： 克隆原意为“扦插的枝条”无性繁殖系 基因克隆（实为基因扩增） 细胞克隆（实为有丝分裂的细胞集落） 个体克隆（如植物快繁个体） 引伸为“克隆操作技术，即核移殖技术”,二、理论基础： 体细胞具有细胞全能性,三、发展历程：,622 细胞核移植（也是克隆技术关键）,一、定义 细胞核移植技术：是指利用显微操作技术将 某种动物细胞核移入同种或异种动物的去核成熟 卵内的精细技术； 它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植； 它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生 物学等问题的研究，实现不同细胞核与细胞质的 组配，还能培育出新物种。,二、发展历程,三、核移植技术,供体和受体的准备 鱼类： 供体囊胚细胞或成体细胞， 受体成熟的卵细胞 发育 （人工催产、水中激活） 时间 两栖类： 配合 供体囊胚细胞或成体细胞， 好 受体成熟卵细胞（人工针刺）,鸟类、爬行类：未知 哺乳类： 供体早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细 胞；后用体细胞，如乳腺细胞、粘 膜上皮细胞；合子核到64细胞期， 0.2%链霉蛋白酶预处理,溶去胚胎 胶膜及透明带,分离单个卵裂球； 受体去核卵母细胞、受精卵、2细胞胚 胎（第一极体成熟时期去核）；,去卵膜和卵核用玻璃微针（尖为2-4um） 鱼卵借助第二极体标志，去核； 两栖卵紫外线去核； 哺乳卵借助第一极体； 供体细胞制备： 胚胎或组织机械切割 置细胞分离液 （含胰蛋白酶）处理几分钟 单细胞短期培养 移植 选择合适微吸管（比细胞核大，比供体细胞小 ），不能多带细胞质，须30-40min内完成操作过 程，温度16-18C；,显微操纵术：原子力显微镜、显微操纵仪；,显微操作仪,核移植操作过程,623 克隆动物一般制备技术,一、胚胎细胞核移植法 世界： 1984年，英，绵羊; 1995年，日本； 1997年，澳大利亚，孪生牛; 1998年，食用牛 目前，小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、羊、猴 中国： 1990年，中国发育所，兔；西北农大，山羊; 1991年，台湾，猪 ; 1992年，江苏农科院，兔 ; 1995年，中国发育所与扬州大学，山羊; 1995年，华南师院与广西师大，克隆杂色牛; 1995年，西北农大，猪 1996年，湖南医科大，小鼠,二、胚胎干细胞核移植： 鼠，8细胞前胚胎， 细胞全能性明显 三、胎儿成纤维细胞核移植： 1996年，3只山羊,624 体细胞克隆技术,一、体细胞克隆技术： 是指将动物体细胞经过抑制培养， 使其处于休眠状态，利用细胞核移植技 术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎 后移植到受体，妊娠产仔，克隆出非成 体动物。,20世纪，50年代，体细胞克隆出成体 蛙，但哺乳类个体不成功 1997、2、23，英格兰、爱丁堡罗斯林 研究所与PPL制药公司，伊恩.维尔穆特博 士研究小组，用白绵羊细胞核+黑绵羊去 核卵母细胞，培育出克隆绵羊“多莉”，现 存活,1998、7，美国，夏威夷大学，用豚鼠细 胞核+黑鼠去核卵细胞，培育出50只克隆鼠 ，克隆猪 2002、1，中国，克隆牛（卢光锈，中南 大学，干细胞，克隆人胚胎）,2005、8，经过李宁教授领导的课题组 一年多的科技攻关，8月5日，我国第一头 体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生 。该项目得到了国家重点基础研究发展规 划“973”项目以及北京市自然科学基 金资助。,2005、12，中国农业大学，高产奶牛体细胞 克隆技术的研究获得突破，利用成年母奶牛成 纤维细胞、颗粒细胞和胎儿成纤维细胞、胎儿输 卵管上皮细胞作为供体核克隆时重构胚的囊胚发 育率，分别为41%、41%46%和39%。克隆胚胎 的移植后60天妊娠检查时，妊娠率为35.2% （51/145），妊娠母牛早期流产率为15.2% （8/51，指妊娠159天前），早产率为4% （2/51，指妊娠7-8个月）。,体细胞克隆高产奶牛,2006、2，美国科学杂志日宣 布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早 期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科 学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细 胞。 汉城国立大学和美国密歇根州立大学等 机构的科学家参与了这项研究。名健康 妇女为这项研究志愿捐献了个卵细胞 以及被称为卵丘细胞的体细胞。,科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其 植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用 化学手段刺激卵细胞分裂，共有个克隆细胞经 过约天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被 称为胚囊的早期胚胎阶段。科学家们从这些胚囊中 分离出个内层细胞团，并在此基础上最终获得 一个人类胚胎干细胞系。实验显示，利用这种办法 获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细 胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。,克隆人早期胚胎(1),克隆人早期胚胎(2),2006、3，中国首批转基因体细胞克隆牛的再克隆体日前成功降生。,克隆羊借腹生子津城落地,克隆动物可以自然交配,中国转基因克隆技术再破难关,荧光小猪,625 克隆技术的应用与意义,一、无性繁殖意义为：有利于保护柔弱的 胚胎期；有利于大量快速繁殖。 二、检验动物细胞全能性（理论上）； 三、加速动物繁殖，优良育种，保护珍稀 动物； 四、用于医药领域克隆动物（器官大 小与人相当），培育组织、器官，如 用猪肝、羊颅骨、鸡肌腱、猪关节软 骨作替代器官；,626 存在的问题,一、技术尚不成熟：克隆动物成功率低，死亡 率高； 二、克隆动物的体细胞突变、寿命和其他遗传 问题，如无遗传物质交换，适应力差，易 突变； 三、理论问题：克隆并非完全复制，体细胞也 有变异，理论问题值得深入； 四、社会伦理问题：从医学上讲，赞同者多； 从伦理上讲，反对者多；难判断；,627 克隆技术发展趋势,克隆技术与转基因技