课件：高美华《医学免疫学》 -2014年秋季.ppt

可提取性核抗原（ENA）自身抗体检测 Western Blot法,Western Blot是将蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原-抗体反应进行特异性检测。 本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和 ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，可分辨10-100 ng的蛋白质，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。,一、实验原理 Western Blot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行。 第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。 第二阶段：电转移。 第三阶段：固相酶免疫测定。,二、试验方法 （一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,1. 试剂材料 1) 30 凝胶贮备液：含29 （W/V）丙烯酰胺和1 （W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中。 2) 10 SDS，去离子水配制，贮存于室温中。 3) TEMED（N,N,N,N-四甲基乙烯二胺）。 4) 10过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多4贮存一周。 5) 浓缩胶电泳缓冲液 Tris-HCl（PH 6.8）。分离胶电泳缓冲液Tris-HCl（PH 8.8 ）。 6) 电泳缓冲液：Tris-甘氨酸 （PH 8.3）。,7）上样缓冲液： 100 mmol/L Tris-Cl （PH6.8） 200 mmol/L 二巯基乙醇 10 % SDS 0.2 %溴酚兰 20 %甘油 8）ENA：用pH7.4 0.01 M PBS从牛胸腺丙酮粉中抽提，浓度为5 mg/mL，-70 保存备用。 9）垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴头、EP管、吸管等。 10）考马斯亮蓝染液、丽春红染液。,2. 实验方法 1) 玻璃L准备：依次用水、10 SDS、H2O、乙醇和水冲洗，干燥。 2) 配制分离胶：总量5 mL，其中： 水 1.65 mL 30 丙烯酰胺溶液2.0 mL 1.5 mol/L Tris-HCl（PH 8.8） 1.25 mL 10 SDS 0.05 mL 10 过硫酸铵 0.05 mL TEMED 0.002 mL,3) 配制浓缩胶：总量2ml，其中： 水 1.385 mL 30 丙烯酰胺溶液 0.325 mL 1.0 mol/L Tris-HCl（PH6.8） 0.25 mL 10 SDS 0.02 mL 10过硫酸铵 0.02 mL TEMED 0.002 mL 将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子，应小心避免气泡。,4) 加样：将ENA与上样缓冲液等体积混合，煮沸35 min后，将其加入梳孔内，每孔20 L。 5) 电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 6) 染色：取下凝胶，切下一部分染色，其余用于电转移。,（二） 电转移： 蛋白蛋从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜,一、材料 转移缓冲液、转移电泳槽、电泳仪、稳压器、PVDF膜、Whatman3MM滤纸、海绵等,二、方法 1剪6块滤纸和一块PVDF膜，其大小应与SDS凝胶的大小相同。如果纸或膜比凝胶大，在转移过程中会形成局部短路影响转印效果。 2将剪好的3MM滤纸及PVDF膜在甲醇中提前浸泡5-10 min。,3、按下列过程安装转移装置： （1）将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。 （2）将3块3MM滤纸对齐放在海绵上，依次放置PVDF膜、凝胶、另外3块3MM滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。 （3）最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意PVDF膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。,海绵,3层滤纸,塑料支架,3层滤纸,海绵,塑料支架,PVDF膜,凝胶,+,-,4、接通电源，电压40 V，电流0.17-0.2 A，转移1.5-6 h，转移时间可根据靶蛋白的大小来定，蛋白质分子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长。 5、转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔在膜的上缘作好标记。 6、切下部分PVDF膜，丽春红染色观察转印情况。 7、在标记好的上缘用蘸有人IgG的钢笔划一条线。,（三）固相酶免疫测定 检测ENA（extractable nuclear antigen）自身抗体,一、材料 1、洗涤液：含0.05 吐温-20 的PH 7.4的PBS 2、酶标抗人IgG 3、阴性对照血清、阳性对照血清 4、底物溶液 5、终止液 6、已转印有ENA的PVDF膜。 7、恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、 滴管、吸管等。,二、方法 1切下数条已转移有ENA的PVDF膜。 2封闭（用1的牛血清白蛋白4过夜）。 3洗涤液漂洗5次，每次1 min。 4加样：1 mL洗涤液加入20 L血清，37 恒温摇动40 min。 5洗涤液漂洗5次，每次1 min。 6加入1 mL酶标羊抗人IgG，37恒温摇动30 min。 7洗涤液漂洗5次，每次1 min。 8加入底物液1 mL，显色3-5 min。 9加入终止液终止反应。,三、结果判断 用肉眼观察。出现染色条带为阳性，不出现染色条带为 阴性，不同的疾病可以出现不同的条带。跟据条带位置 判断结果。 判断标准： 1抗Sm抗体：同时出现29KD、28KD、13.5KD条带。 2抗SSA抗体：60KD、52KD任意出现一条带。 3抗SSB抗体：47KD、45KD应用时出现条带。 4抗Jo-1抗体：55KD出现条带。 5抗Scl-70抗体：同时出现86KD、67KD条带。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下