课件：抗肿瘤药物的筛选方法.ppt

抗肿瘤药物筛选,张冬梅,一、导论 二、整体动物水平的筛选 三、细胞水平的筛选 四、酶水平的筛选 五、展望,一、导论,1. 肿瘤发病率和死亡率,全球每年癌症新发病例都在1200万以上，因癌症死亡人数达760多万，到2010年底全球肿瘤病人总数已逾5500万人 (WHO)。,心脏病,脑血管病,肿瘤 25%,消化系统病,肺病,其他,中国每年新增肿瘤病人200万人，死亡130-170多万人左右，目前全国肿瘤患者总数约450万人，并以每年3%的速度递增。肿瘤已经成为中国公民的头号杀手，每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡率的22%。,2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成,(中国卫生年鉴),9年中国常见恶性肿瘤的死亡率,我国居民常见癌症死亡率: 胃癌列肿瘤死亡率首位; 其次肝癌、肺癌、食管癌、结直肠癌等。,外科手术治疗 放射线治疗 化学药物治疗,3. 常用的化疗药物,烷化剂 环磷酰胺、异环磷酰胺 抗代谢药物 甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷 抗肿瘤抗生素 柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星 铂类化合物 顺铂、卡铂、奥沙利铂 抗肿瘤植物药 长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇 激素类 血管新生抑制剂 贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼,化疗药物的主要不良反应,骨髓抑制（血细胞减少） 胃肠道反应（恶心、呕吐、食欲不振等） 全身反应（脱发、发热、皮疹） 对各器官影响 （心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性） 泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病） 局部静脉炎 致畸、致突变、致癌,4. 天然产物与抗肿瘤药物,天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。 美国国立癌症研究所（NCI）从1955年开始从天然产物中筛选抗肿瘤药物。 目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,以上来源于天然产物。,二、整体动物水平的筛选,非实体瘤动物模型,常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物） 国内外推荐模型,肿瘤移植方法：,1）无菌操作 2）接种部位：腹腔 3）癌细胞悬液的制备及接种 接种710天小鼠处死，酒精消毒，穿过腹 部肌肉吸取腹水24 mL*，置冰块上保存。细胞计数后，PBS稀释制备1x107/0.1 mL细胞浓度悬液，每只小鼠注射0.2 mL 肿瘤细胞悬液注射到腹腔。5天左右，小鼠出现腹水即为造模成功。 *腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去,给药及药效评价：,动物分组：随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低 给药组）；每组8-10只。 药品制备：药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液 给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上 评价指标：观察记录荷瘤小鼠的存活天数（30天） （7天死亡率20%或20%动物存活超过4周，实验失败 对照组存活时间14-20天） 数据处理： 生命延长率(%) 治疗组存活天数对照组存活天数 对照组存活天数 非腹腔给药生命延长率50% 腹腔给药75%,x100%,. 实体瘤动物模型,1）动物移植性肿瘤,常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）,国内外推荐模型,肿瘤移植方法：,1）无菌操作 2）接种部位：右前肢腋下 3）癌块的制备及接种 接种710天小鼠处死，酒精消毒，切开皮肤取出肿瘤块，置于生理盐水中，冰块上保存。剪碎瘤块成2-3 mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液，接种到右前肢腋下。5天左右，小鼠出现瘤块即为造模成功。,7天后对照组20%小鼠肿瘤小于400 mg或大于2g，实验失败,给药及药效评价：,给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天 评价指标：记录小鼠的体重变化。12天后，处死小 鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左右）。 取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目 数据处理： 抑瘤率(%) 对照组瘤重治疗组瘤重 对照组瘤重 抑瘤率30% 认为有效,x100%,）人癌异种移植模型,细胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞 动物： 裸鼠 （nude mice） 特点： 1）裸体，行似无毛； 2）不能执行正常T细胞功能，免疫力低下 3）B细胞功能正常，NK细胞活性高,T淋巴功能缺陷 先天性无胸腺小鼠 11号染色体上隐性 突变裸基因（nu）,肿瘤移植和给药方法：,1）无菌操作 2）接种部位：背部 3）细胞悬液的制备及接种 细胞悬液浓度1x108/mL，接种0.1mL到背部。7天左右，瘤块达到50 mm3体积即为造模成功，开始给药。 4）给药时间：根据药效确定，一般12-60天。,阳性药,5-Fu （5-氟尿嘧啶） ADM （阿霉素） Taxol（紫杉醇） CTX（环磷酰胺） 选择性对照药 推荐剂量：1-20 mg/kg 给药方式：与测试药物相同;常隔天给药,药效评价：,评价指标：记录小鼠的体重变化。结束治疗后，处 死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左 右）。取脾脏称重，并测定脾细 胞数目。 数据处理： 抑瘤率(%)对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积 对照组肿瘤体积 抑瘤率30% 认为有效,x100%,抗肿瘤谱,Taxol （卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋巴瘤） 5-Fu （乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤） ADM （ 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）,沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用 (Carcinogenesis, 2013, 34:1331),三、细胞水平的筛选,1. 抑制肿瘤细胞增殖实验 2. 诱导肿瘤细胞分化实验 3. 诱导肿瘤细胞凋亡实验 4. 抗肿瘤血管生成实验 5. 肿瘤多药耐药性逆转实验 6. 抗肿瘤侵袭和转移实验 7. 诱导肿瘤细胞自噬实验,细胞株的选择,. 抑制肿瘤细胞增殖实验,A) 噻唑兰实验（MTT） 原理： 活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT，生成蓝紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。,MTT 原理示意图,甲臜生成量正比于活细胞数 采用比色法（570 nm）测定甲臜生成量,实验方法,1）细胞培养 培养液：RPMI 1640、DMEM、MEM、 M199、McCoys5A等 血清： FBS、NBS、 抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、 新生霉素等 胰酶： Trypsin-EDTA 、Collagenase 缓冲液： PBS、HBSS等 生长因子：EGF、B-27、N-2等,2）细胞传代 贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。 3）细胞计数 细胞计数板,5）细胞接种 3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁 24小时，或对数生长期 6）加药处理72 h（指定时间点） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小时 8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的 甲臜 9）酶标仪测定OD值,结果处理：,肿瘤细胞生长 抑制率（%）,=,（ OD对照-OD实验）,OD对照,X 100%,根据生长抑制的量效曲线求出IC50 值,肿瘤细胞存活率（%）=,OD实验,OD对照,X 100%,A,B,问题：根据上图中细胞生长抑制曲线， 判断化合物A和B哪一个具有较好的 肿瘤生长抑制作用？,）磺酰罗丹明B （SRB）实验,原理： SRB是粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物，是蛋白结合染料，与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色，用酶标仪测定其吸光度。 细胞中的蛋白含量与吸光度成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目和活性。,方法： 类似于法，10-20%三氯乙酸固定1 h 后，加入0.5-1%染色30 min，洗去 染料，空气干燥后，加入10 mM Tris 溶解 后，50 nm测定光密度 结果处理：同法,）细胞排染法（酞酚蓝）,原理： 细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正 常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。,伊红、苯胺黑 等染料,细胞死亡率 （%）,对照组活细胞数给药组活细胞数,对照组活细胞数,X100%,=,结果：,方法： 细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板，分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）,. 诱导肿瘤细胞分化实验,NBT还原法 原理：硝基蓝四氮唑兰(NBT) 还原法测定细胞株分化 诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃, 细胞内还原型辅酶含量增加, 将可溶性NBT还原 为不溶性蓝紫色颗粒, 而沉积于细胞浆内。 方法：HL-60 细胞株是筛选分化诱导剂的,药物作用后, 细胞形态向粒细胞方向分化。 结果：显微镜计数NBT还原阳性细胞，计算诱导分化率,对照组,药物处理组,. 诱导肿瘤细胞凋亡实验,）形态学观察（透射电镜） 原理：细胞超微结构观察 方法：药物处理后，收集细胞，4%戊二醛固定2 h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1 h,酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片做成铜网，经醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜下观察拍照。,对照组,凋亡细胞,正常细胞胞质散在内质网、核膜清楚、染色质均匀、核仁明显。,凋亡细胞染色质浓缩、致密，沿核分布形成新月体状，有凋亡小体出现。,对照组,坏死,线粒体肿胀,凋亡细胞胞质出现明显的线粒体肿胀。,坏死细胞细胞膜不完整，核膜破裂，染色质呈虫蚀状溶解。,B）DNA形态观察（Hoeschst333258） 原理： Hoeschst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光 方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后，在荧光显微镜下观察 结果：活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细胞质内可见强荧光的颗粒状物质。,对照组,药物处理组,C）染色体断裂测定,原理：凋亡细胞内源性核酸酶激活，链被切割成200 bp不同倍数的片段，将这些片断进行电泳，可观察到梯带 方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取，上凝胶电泳，染色后，灯下观察。 结果：凋亡细胞显示梯带。,CTL,DRUG1,DRUG2,MARKER,）PI/Annexin-FITC双染色分析,原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞 表面，PS结合标记荧光素FITC的Annexin-V 但细胞膜仍然完整，荧光染料不能进 入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V 和PI的双标记。 方法：肿瘤细胞同时加入Annexin-和染色， 用流式细胞仪分析。,正常细胞 Annexin-V (-) PI (-),晚期凋亡细胞 Annexin-V (+) PI (+),早期凋亡细胞 Annexin-V (+) PI (-),Annexin-V,PI,PI/AnnexinV-FITC 双染激光共聚焦分析结果,PI红色荧光细胞核,AnnexinV-FITC 绿色荧光 细胞膜,Annexin-V-FITC,PI,对照组,药物处理组,. 抗肿瘤血管生成实验,肿瘤发生、生长和转移与新生血管形成密切相关，当肿瘤直径超过2 mm时,直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要,此时肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。 肿瘤血管生成抑制剂能抑制血管生成,阻止肿瘤生长和转移，在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、不易产生耐药性等优点。,）血管内皮细胞体外筛选模型,原理：体外培养的血管内皮细胞在含生长因子条件下 能形成细胞条索，然后形成管状。肿瘤血管生 成抑制剂能抑制细胞管腔的形成。 方法：人脐静脉血管内皮细胞在含有药物和不含有TAI 药物的胶原凝胶中分别培养后,在显微镜下比较 它们形成的管腔数目。,对照组,药物处理组,）鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型,原理：鸡卵在胚胎发育过程中，尿囊膜上的血管生长 很旺盛，将不同药物作用于尿囊膜，观察该膜 上的血管生长。 方法：鸡胚胎放在直培养皿内, 在无菌恒温箱中孵育 到第9 天的生长高峰时,将浸泡过药物 的明胶 海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面，培养天，在 显微镜下随机取几个视野点,记数“热点”区的新 生血管数,计算平均值。,血管生成 抑制率（%）,对照组血管面积给药组血管面积,对照组血管面积,X100%,结果：,CTL,低剂量药物,高剂量药物组,）斑马鱼血管新生模型,斑马鱼被广泛地应用于药物筛选方面的研究。主要用于筛选抗血管生成药物。 其胚胎早期发育的过程中,血管生成的模式比较简单, 主要出现在头部和躯干部体节间,体节间的血管最初由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间。,斑马鱼胚胎,方法：在96 孔板上用药物处理胚胎,通过血管内源 性碱性磷酸酶染色来显示血管,进而评价药 物对血管生成的作用。 结果：,耐药性逆转实验,肿瘤细胞耐药性，分先天性耐药性和获得性耐药性，也可分为原药耐药性和多药耐药性。多药耐药性基因mdr1编码表达P-糖蛋白（P-gp）是产生耐药性的主要机制。P-gp将化疗药物泵出体外，降低药物在细胞内的浓度。 ）肿瘤耐药性体外模型的建立 逐步增加肿瘤细胞培养基中抗癌药物的浓度（Dox）诱导产生肿瘤耐药株。用MTT法检测药物对敏感株和耐药株的细胞毒性，同时测定mdr1基因和P-gp表达水平。,耐药株,敏感株,P-gp,敏感株,耐药株,2) 逆转肿瘤多药耐药性作用的药物筛选,方法：采用MTT法测定加逆转剂前后DOX对耐药株的细胞 毒性。计算逆转效果.,FR (逆转倍数)=,IC50(不加逆转剂) / IC50(加逆转剂）,Effect of NSC23925 to reverse drug resisitance in MDR cell lines,用荧光酶标仪、荧光显微镜或流式细胞仪检测加药前后耐药细胞株内抗癌药多柔比星Dox的含量。,Control,0.5 uM Dox +1 uM Vep,0.5 uM Dox,0.5 uM Dox +5 uM Vep,0.5 uM Dox +10 uM Vep,HepG/ADM Control,Verapamil 5 mM,Drug 1.25 mM,Drug 2.5 mM,Drug 5 mM,多柔比星累积实验,Rhm123累积实验,Control,Verapamil 5 mM,Drug 1.25 mM,Drug 2.5 mM,Drug 5 mM,6. 抗肿瘤侵袭和迁移实验,转移是恶性肿瘤的重要特征 肿瘤的迁移是一个多阶段的复杂过程，Liotta等提出肿瘤侵袭和转移的三步学说，即粘附、降解和移动。粘附是肿瘤细胞侵袭的起始，肿瘤细胞通过表面特定受体与基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和型胶原等相粘连，然后在蛋白水解酶和相关因子的作用下，侵袭基底膜，降解细胞外基质肿瘤细胞一旦突破基底膜，逃避免疫监视，即在基质内较快侵袭性生长并发生转移。 阻断其中任何一个过程，都可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,）粘附实验 原理：将Matrigel铺在96孔板上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构，可以有效地在体外模拟肿瘤细胞的粘附过程。 方法：将Matrigel包被96孔板，过夜，将药物处理后的细胞接种在96孔板，1h后，弃去未粘附的细胞，加入MTT培养，测定吸光度。 结果：,细胞粘附 抑制率（%）,=,（ OD对照-OD实验）,OD对照,X 100%,2）细胞划痕实验（运动能力检测）,方法：细胞按30000个/孔密度接种于6孔板，待细胞贴壁生长到90%融合度，用20 uL移液器枪头在每孔划出十字形划痕，PBS清洗后，加入药物处理后（无血清培养基），显微镜下观察拍照。,A B C D E A: Control; B: Drug 20 nmolL-1; C: Drug 30 nmolL-1; D: Drug 40 nmolL-1; E: Drug 50 nmolL-1,细胞运动能力实验,Transwell技术,3）细胞迁移和侵袭实验,原理：肿瘤细胞在趋化因子的作用下可 穿透聚碳酸酯膜，从上室转移到下室，有些药物可抑制这种迁移。,方法： （1）Transwell小室的制备 Matrix包被并水化基底膜 （2）制备细胞悬液 110 x 105的细胞/200 uL （3）细胞接种 下室20% FBS的培养液，上室无血清培养液 （4）细胞培养24-48 h （5）细胞染色，拍照并计数,A: Control; B: Drug 20 nmolL-1; C: Drug 30 nmolL-1; D: Drug 40 nmolL-1; E: Drug 50 nmolL-1,细胞迁移能力实验,细胞侵袭能力实验,A: Control; B: Drug 20 nmolL-1; C: Drug 30 nmolL-1; D: Drug 40 nmolL-1; E: Drug 50 nmolL-1,6.自噬实验,自噬： 是以细胞器的自我消化和更新为特征生化过程 过程： 粗面内质网脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。 生物功能：一般认为自噬是保护细胞，但是也可以诱导细胞 发生自噬性死亡。,自噬过程,自噬的特征,自噬的检测,MDC法 原理：自噬小泡呈偏酸性，绿色的荧光 染料能选择性聚集 方法：加入（）处理15min 后， 激光共聚焦显微镜观察,LC3-GFP,原理： LC3-GFP绿色荧光蛋白克隆细胞株，出现自噬时伴随LC3高表达，呈现绿色荧光染料 方法： 药物处理预定时间后，激光共聚焦显微镜观察,相关蛋白表达,LC3 Atg5 Beclin 1 p62,四、酶水平的筛选,拓扑异构酶抑制剂筛选 端粒酶酶抑制剂筛选 VEGFR 酪氨酸蛋白激酶酶抑制剂筛选 组蛋白去乙酰酶抑制剂筛选 基质金属蛋白酶抑制剂筛选 法基尼转移酶抑制剂筛选 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选,拓扑异构酶抑制剂筛选,DNA拓扑异构酶是一种重要的核酶，通过DNA链断裂和重接而改变DNA的拓扑结构，调节其空间构型变化，在细胞生长过程中起重要作用,方法：裂解细胞, 提取拓扑异构酶, 测定酶总量或酶活 性的变化, 在酶反应体系中，加入负超螺旋 pBR322 质粒DNA, TOPO 酶提液及不同浓度的药 物，温育30 min后，加入反应终止液，在琼脂糖 凝胶中电泳, 溴化乙锭染色紫外灯下观察。 结果：,端粒酶抑制剂筛选,端粒是染色体特殊结构, 起着保护染色体的完整和稳定性的作用, 端粒酶是一种核糖核蛋白反转录酶, 可以自身RNA为模板合成端粒末端。正常细胞端粒酶活性是阴性, 而在肿瘤细胞株表达高活性。,方法：裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白含量， 扩增，凝胶电泳，银染色 结果：端粒是由短DNA 重复序列组成,而端粒酶的作 用是维持端粒末端的长度,因此PCR 扩增产物 间接反映端粒酶活性。,药物对肿瘤细胞端粒长度和端粒酶活性的影响,VEGFR酪氨酸蛋白激酶抑制剂筛选,VEGFR 受体酪氨酸蛋白激酶能特异性地将磷酸根转移到蛋白质的酪氨酸残基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关。 以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发成为国际上抗肿瘤药物研究的热点。,受体酪氨酸激酶结构示意图,肿瘤相关的受体酪氨酸激酶,ELISA方法： 以96孔酶标板作为实验容器,加入包被液谷氨酸酪氨酸多聚多肽，孵育过夜。加入受试物和酪氨酸激酶反应1 h后，加入辣根过氧化物 酶标记的小鼠抗磷酸化酪 氨酸单克隆抗体,室温反应 30 min后, 用酶标仪读 取吸光度(OD)值。,Q and A,试求出不同浓度对酪氨酸蛋白激酶的抑制率,组蛋白去乙酰酶抑制剂筛选,组蛋白是核小体的重要组成部分，组蛋白的乙酰化后，DNA构象易于展开，核小体的结构松弛，利于转录因子和协同转录活化因子与DNA的接触，激活基因转录过程。,组蛋白乙酰化酶（HAC）和去乙酰化酶（HDAC）的协同调节作用决定了组蛋白和部分非组蛋白的乙酰化水平，是特定基因表达的切换开关。 组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过组蛋白和非组蛋白的乙酰化，阻断细胞信号传导途径某些蛋白的活化，而发挥抗肿瘤活性。,原理：含乙酰化赖氨酸的短肽被HDAC区去乙酰 化后，发出荧光（353 nm 和448 nm）. Boc-(Ac)Lys-AMC + HDAC Boc-Lys-AMC 无荧光 荧光 方法：在96孔板中依次加入反应缓冲液、短肽 底物、HDAC酶以及不同浓度的抑制 剂，37孵育30-60 min，加入显色液 终止反应，用荧光酶标仪测定荧光强度,Trichostatin A抑制HDAC酶活性,基质金属蛋白酶抑制剂筛选,基质金属蛋白酶（MMPs）为胶原酶，是一种金属离子依赖的蛋白酶，可有效降解基底膜的主要成分胶原及明胶，它的异常表达与恶性肿瘤的转移密切相关。 MMPs其主要功能是降解细胞外基质,参与血管形成、炎症、肿瘤的侵润及转移等。,原理：荧光共振能量转移技术（FRET） FRET肽段底物经MMPs酶催化断裂， EDAN片段发出荧光（340/490 nm）,方法：在96孔或84孔板中依次加入反应缓冲 液、FRET肽底物、MMP酶及抑制剂混 匀，5-60 min 内连续测量荧光强度。 试验组设置: 阳性对照组（含MMP酶） 抑制剂组（含MMP酶和抑制剂） 溶剂对照组（含MMP酶和测试溶剂） 底物对照组（仅有底物） 测试药物组（含MMP酶和测试药物）,法尼基转移酶（Ras）抑制剂筛选,Ras蛋白是调节细胞生长和增殖的信号通路的重要元件, 是控制外来分子信号的分子开关。Ras蛋白以GDP结合和GTP结合两种形式存在。,原理： (pull down assay) 活化形式的GTP-Ras与下游的效应蛋白 Raf（Raf有Ras-binding domain，Raf- RBD）结合。 Raf-RBD-GST融合蛋白固化谷胱甘肽亲 和树脂 （GSH），与含有GTP-Ras的样 品孵育，Raf-RBD与GTP-Ras充分结 合，洗脱后，经免疫印迹检测Ras的表 达量。,GSH resin,GST,Raf-RBD,GTP-Ras,Anti-Ras antibody,丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选,丝裂原活化蛋白激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，将细胞外刺激信号传导到细胞核内，并引起细胞的生物学反应，如增殖、凋亡、分化等。主要有三条信号通路：ERK （Extracellular s