课件：血型分子诊断技术进展与应用.ppt

血型分子诊断技术进展与应用,主要内容,红细胞血型系统分子诊断 红细胞血型系统分子基础 ABO血型系统 Rh血型系统 H血型系统(类孟买型) 红细胞血型系统分子诊断技术及其应用 小结,有关分子生物学概念,点突变 同义突变 无义突变 有义突变 起始密码突变 缺失 插入 重排,有关分子生物学概念,基因结构异常或表达异常 点突变 插入 缺失 易位和重排 拷贝数扩增 DNA多态性 基因的检测,常见突变示意图,ATG CGG TAG CGT AGT CTG ATG CGA TAG CGT AGT CTG ATA CGG TAG CGT AGT CTG ATG CGGG TAG CGT AGT CTG ATG CG TAG CGT AGT CTG,新等位基因形成,红细胞血型系统,40个基因 1250个等位基因(截止2012年5月12日) 参见Blood Group Antigen Gene Mutation Database,红细胞血型分子机制,点突变 同义突变、无义突变、 有义突变、起始密码突变、拼接接受位点 插入 缺失 基因重组（RHD/RHCE） 基因部分重复 /projects/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/systems,ABO血型分子生物学研究,1990年Yamamoto等首次克隆 基因定位于染色体9q34 ABO基因cDNA，其分子量为41,000 Dalton，DNA长度为1062bp ABO血型系统为三复等位基因，有A、B、O三个基因 ABO基因包括7个外显子，长度大于18kb 大多数编码序列位于第6和7外显子,ABO基因示意图,常见等位基因,A和B基因 编码的蛋白都是353个氨基酸，O基因编码的蛋白只有 115个氨基酸 A101、A102、B101、O01、O02 A101作为参考序列 A102等位基因 C467T(Pro-Leu) B101基因在297、526、657、703、796、803、930、1096位有8个核苷酸与A101基因不同 但只有526、703、796、803四个核苷酸的变化造成了氨基酸序列的变化（A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，B101依次是甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和丙氨酸） O01基因在261位的G缺失,提前终止,ABO亚型频率分布,ABO血型中存在ABO亚型 临床输血和献血者检测中常见 440617份 A亚型22份 AxB 11例，AelB 3例，Ax 3例，Ael 2例，Amh 2例，A3 1例 B亚型41份 Bx11例，B39例，ABx7例，AB3 5例，Bel3例，Bm 2例，ABel 1例，ABend 1例，ABm 1例，Bend 1例。 B(A)1例 CisAB2例 A2 14例 A2B 35例 引自中国输血杂志2006，19（1）：25,ABO亚型的分子研究,通过检测261、526、703、796、803位的核苷酸可以确认大多数典型的ABO血型的基因型 近年来对血清学分类的ABO血型亚型抗原，应用PCR、DNA测序等技术，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上进行研究 结果表明：原为同一亚型的抗原存在异质性，即血清学上同一亚型，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差异。 几个位点以外的核苷酸变化引起的ABO血型亚型常会引起检测结果的偏差 发现的等位基因数为290个（2012年05月22日）,A等位基因,可简要分为7大类等位基因 A1、A2、A3、Ax、Ael、Aw、Am A101等位基因序列作为参照标准 A102(C467T)（在中国人群中比例大于A101) A103(C467T,C564T) A104(A297G) A105(A297G,B-O1重组) A106(B-O02重组) A205(A1009G ),B等位基因型,可简要分为5大类等位基因 B1、B3、Bx、Bel、Bw B等位基因中297、703、796、803位基本恒定 B101-B118 B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096A B301-B308 B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A, G803C, G930A, G1096A, C1054T,O等位基因,O01O74 大多数261nt缺失，13个261nt不缺失 O01:261delG O02:261delG、T646A、G681T、C771T、G829A 人群中常见 003:261G、A297G,C526G,G802A O50,CisAB和B(A)等位基因,CisAB01-06 CisAB01:C467T,G803C CisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C, B(A)01-06 B(A)型单克隆试剂应用于临床后，抗A试剂偶尔与原定为B型的红细胞发生反应，这类含有大量B抗原极少A抗原的红细胞称之为B(A)型 B(A)01:A297G,C526G, 796A,G803C,G930A,G1096A B(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A, C796A,G803C,G930A,G1096A,实验室发现的ABO等位基因,A208 allele* C467T; G539C A210 allele* 268TC;467CT A211 allele* 266CT;467CT B112 allele* 297AG; 526CG; 559CT;657CT; 703GA; 796CA; 803GC;930GA B305 allele* 297AG; 425TC; 526CG; 657CT; 703GA; 796CA; 803GC; 930GA B307 allele* 297AG; 410CT; 526CG; 657CT; 703GA; 796CA; 803GC; 930GA Bw12 allele* C278T CisAB05 allele* A297G; C526G; C657T; G703A; C 796A; G930A O61 allele* 261del 743C,ABO基因诊断,PCR-SSP PCR-RFLP PCR-SSO PCR-SSCP PCR-SBT 261G干扰 正反定型不一致,ABO亚型分子机制和诊断,凝集强度改变 正反定型不一致 点突变为主 PCR-SSP 261G PCR-SBT SNP(单核苷酸多态性),ABO亚型分子机制和诊断,PCR-SBT 常见为6-7外显子扩增 双向测序 存在风险：扩增引物SNP 多态性位点在其它位置 其它机制：表观遗传、其它,ABO亚型分子机制和诊断,PCR-SBT 1-7外显子扩增技术和策略 全长18kb 一般3对引物以上 外显子上的突变 ATG位置突变 其它机制？,ABO亚型分子机制和诊断,基层实验室如何有效获取信息 血清学结果 家系分析 保存抗凝全血-20以下 寻求分子诊断实验室帮助,Rh血型基因,基因位于1号染色体短臂上，即1P3436 两个基因：RHD编码D抗原，RHCE编码CcEe抗原 RHD和RHCE基因同源性高达96%以上 RHD和RHCE基因均有10个外显子,RHD基因第1、2、8、10外显子的编码序列与RHCE的相对应序列相同 RHD基因第3、4、5、6和第9外显子序列与RHCE基因有区别 两个RH基因紧密连锁，相隔30000bp 两个基因的3末端面对面 两个基因之间有一个独立的基因SMP1 RHD和RHCE两个基因之间以及外侧分别有1个Rhesus盒 SMP1基因距中间一个Rhesus盒下游仅15bp,RHCE和RHD基因组成示意图,1p34-p36,Rh血型等位基因,RHAG RHD RHCE 突变和缺失、基因转换、基因重组 RHD 218 RHCE 104 RHAG 23,RHD等位基因,RhD阳性 正常RhD阳性 弱D(weak D) 部分D(partial D) Del RhD阴性 RHD基因缺失 RHD基因功能丧失,部分弱D的分子突变点,RHD weak D type 1 T809G RHD weak D type 1.1 C5G; T809G RHD weak D type 2 G1154A RHD weak D type 3 C8G RHD weak D intron 55A intron3 5 G5A RHD weak D type33 (Taiwan1) G520A RHD weak D type Taiwan2 T809A RHD weak D type 51 A594T; C602G RHD weak D type 52 92TC RHD weak D type 53 T740G 分子机制 碱基突变 缺失 mRNA拼接位点变异,部分D分子机制,Partial D 发现等位基因70多个 - RHD Va 2 T667G;G697C;G712A; G1273C RHD Va 3 G697A RHD Va 4 hybrid D(1-4) CE5 D(6-10) RHD VI type I hybrid (D1-3) CE(4, 5) D(6-10) RHD VI type II hybrid D(1-3) CE(4-6) D(7-10) RHD VI type III hybrid D(1, 2) CE(3-6) D(7-10) RHD VI type IV hybrid D1 Ce(2/3-5) D(6-10) 分子机制 基因交换RHD-CE-D 点突变,部分D分子机制示意图,Del分子机制,Del（D elution） 亚洲人群常见 RHD DEL (Cde)1 intron 3 G1A RHD DEL (Cde)2 G885T RHD DEL (Cde)3 intron 9 G1A; G1227A RHD DEL (Cde)4 intron 5 38delCTCT RHD DEL (Cde)5 1252insT RHD DEL (Cde)6 T1203A RHD Del (Cde)7 G3A RHD Del (Cde)8 C28T RHD Del(Cde)9 T53C RHD Del(Cde)10 T251C RHD DEL T1222C RHD Del intron 8-9: del 1013 RHD DEL exon8 del 995nt including 3intron7+exon8+5intron8,RhD阴性的机制,不同Rh阴性表现型频率不同 RHD阴性的可能机制 RHD基因缺失 RHD基因发生改变 RHD-CE-D融合基因 RHD基因的第3到9外显子被RHCE基因取代 RHD阴性个体中约1/3具有完整的RHD基因 非洲D阴性个体具有RHD（假基因）,RHCE等位基因,RHCE等位基因104个 正常RHCE RHce 48C RHCE G48C RHCE(1)D(2-10) RHCE(1)D(2-10) RHCE D-Chinese RH(D1-9CE10) RH(CE1 D2-7 CE8-10) hybrid CE(1)D(2-7) CE(8-10) RHCE 685-687del 685-687delAGA RHCE null amorph 2 Intron 4: G1T,9例弱D样本 RHD 845A 5例（RHD weak D type 15） RHD 1227A 3例（D-el (CDe); minimal expression of D antigen; ） RHD 1013C 1例（RHD weak D type 24） 10例部分D样本 Dva(Kou) 1例 Dva(Hus) 1例 DVa-like(YH) 1例 DVI type III 7例 Molecular basis of D variants in Chinese persons. Transfusion. 2007;47(3):471-7,本实验室部分检测结果,RHD血型分子诊断,RhD阴性 多重PCR技术 FQ-PCR PCR-RFLP D Variant PCR-SSP 测序技术,RHD血型分子诊断,分子机制复杂 RhD阴性分子机制 基因交换RHD-CE-D 疑难标本 单一技术难以判定 多种技术并存 血清学结果,H血型系统,H抗原与ABO血型，Lewis血型密切相关，属于Hh血型系统（ISBT018）,其它血型系统,血清学特性 分子机制 点突变 基因重组 PCR-SSP 基因芯片,其它血型系统,罕见表型 血清学特性 基因定位 测序技术 体外表达,红细胞血型系统分子诊断技术的应用,红细胞血型的诊断 人群遗传的分析 谱细胞血型的诊断 罕见表型分子机制研究 疑难血型的判断 多次输血后的血型检测 产前血型的诊断,红细胞血型系统分子诊断技术的应用,罕见表型 多次输血病人 ABO、RhD血型的不一致 RhD变异体 弱表达的基因情况 RHD杂合度 筛选稀有系统（抗体缺乏） 谱细胞,红细胞血型中采用的技术,PCR-RFLP PCR-SSP 多重PCR技术 PCR-SBT PCR-SSCP PCR-RQ 基因芯片 方法的优缺点 与血清学方法的比较,红细胞血型系统基因分型技术 PCR-RFLP(限制性片段长度多态性),通过PCR扩增出包含突变位点的特定片段 利用限制性内切酶消化 片段经凝胶电泳 不同的片断大小检测便能确认基因型 方法特性 操作较简单 酶切过程需要控制,PCR-RFLP,复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型.中华医学遗传学杂志,1999年第2期,复合PCR 技术在ABO 血型基因分型中的应用,北京医学2007 年第29 卷第2 期,PCR-SSP,利用3碱基特性 分别设计一系列序列特异性引物 直接扩增出目的基因片段 通过凝胶电泳观察 方法特性 简单快捷 易于操作 基于已知序列,PCR-SSCP,选择性扩增基因片段 加热或用变性剂解开DNA双链 由于等位基因的核苷酸顺序的不同，二级结构产生差异 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳迁移率不同 分析电泳带型即可区别开等位基因,DNA测序法,通过PCR扩增基因的主要片段，然后对产物进行序列分析测定，分析发生突变的碱基便可确认血型 血型及其亚型的分子基础 本方法结果准确可靠 需要特殊的仪器设备 操作烦琐，成本高,测序技术,测序技术 双脱氧终止法 化学降解法 高通量测序,Partial sequence in exon 6,O01 allele,Bw12 allele,A novel allele,基因芯片技术,2005年Transfusion 45(5):654-9 Transfusion 45(5):667-679 高通量 同时分析多个系统 多个位点(等位基因） 快速可靠 可自动化 国外产品为主,实时荧光技术(PCR-RQ),Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe phenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction. Transfusion and Apheresis Science 27 (2002) 217223 实时定量 荧光基团 特异性探针 产前诊断,RT-PCR,逆转录 mRNA和cDNA 全部编码序列 无内含子区域 功能研究 克隆 体外表达 突变功能,RT-PCR to amplify