[理学]第六章 酶.ppt

第六章 酶,第一节 酶的概述,（一）酶的概念,酶是由活细胞产生的一类具有催化功能的生物大分子物质， 有称生物催化剂 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。 在酶的催化下发生化学反应的物质称为底物，反应后生成的物质成为产物 酶分胞内酶、胞外酶。,二、酶的催化特点,酶与一般催化剂的共同点,（1）用量少而催化效率高,（2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反 应前后本身不发生变化,（3）降低反应所需的活化能,例 2H2O22H2O+O2,酶作为生物催化剂的特殊点,1、高的催化效率,以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。,例 2H2O22H2O+O2,1mole H2O2酶 能催化 5106mole H2O2的分解,1mole Fe3+ 只能催化610-4mole H2O2的分解,2、高度的专一性,一种酶只能作用于某一类或某一种特定物质这就是酶的专一性可分为： 绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。 相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键的专一性和基团的专一性。 立体异构专一性：这类酶只对底物的某一种构型起作用，而不催化其他异构体。包括旋光异构专一性和几何异构专一性。,3、酶反应条件温和：,反应条件：室温、常压、温和的PH。酶是蛋白质，酶促反应要求一定的pH、温度等温和的条件。凡是超出这些范围酶就会丧失活性。 4、酶易失活：在剧烈条件反而使酶失活，如强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、高温、紫外线、剧烈震荡等任何使蛋白质变性的理化因素都可能使酶变性而失去其催化活性。,5、酶活性的可调节性：,酶是生物体的组成成份，和体内其他物质一样，不断在体内新陈代谢，酶的催化活性也受多方面的调控。 例如，酶的生物合成的诱导和阻遏、酶的化学修饰、抑制物的调节作用、代谢物对酶的反馈调节、酶的别构调节以及神经体液因素的调节等，这些调控保证酶在体内新陈代谢中发挥其恰如其分的催化作用，使生命活动中的种种化学反应都能够有条不紊、协调一致地进行。有胞内酶和胞外酶之分，也有单体酶和多酶复合体之分,三、酶的化学本质与组成,1大多数酶是蛋白质.,1926年美国Sumner 脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质,1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。,J.B.Sumner,J.H.Northrop,1、酶的化学本质,2少数酶是RNA.,1982年美国T. Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性,Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA,据酶分子组成分类,据酶蛋白特征分类,单纯蛋白质酶,结合蛋白质酶 （全酶）,酶蛋白,辅助因子,辅酶 辅基 金属离子,单体酶 寡聚酶 多酶复合体系,（二）酶的化学组成,辅助因子的分类,根据与酶蛋白结合的紧密程度分： 辅酶：与酶蛋白结合疏松(不形成共价键) 辅基:与酶蛋白结合紧密(以共价键相连) 辅酶与辅基无严格区别。 辅助因子直接作为电子、原子或某些化学基团的载体传递作用，参与反应并促进整个催化过程。 酶蛋白决定酶反应的 专一性和高效性，辅助因子决定酶反应的类型,根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类,1单体酶（由一条肽链组成）,2寡聚酶（由两个或两个以上相同或不相 同亚基结合组成的酶）,3多酶复合物（由几种酶依靠非共价键彼此 嵌合而成。）,第二节、酶的命名和分类,1961年国际酶学委员会提出的酶的命名和分类方法。,一、酶的分类,1氧化还原酶类（oxido-reductases）,催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。,（1）脱氢酶类：直接催化底物脱氢,A2H + B A + B2H,例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）,（2）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O,a : AH2+O2 A+H2O 辅基是FAD、 FMN,b: AH2 +O A+H2O,邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）,邻苯二酚,邻苯醌,C:例：,2转移酶类（transferases）,催化基团的转移,例：谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸： 酮戊二酸氨基转移酶）,3水解酶类（hydrolases）,AB + H2O AH + BOH,4裂合酶类（lyases）,从底物移去一个基团而形成双键或逆反应,AB A + B,例1：,例2：,5异构酶类（isomerase）,催化异构化反应,例：,6连接酶类（ligases, 也称synthetases合成酶类）,将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。,例：,1系统名称（systematic name）,（1）标明底物，催化反应的性质,G-6-PF-6-P G-6-P异构酶,例:,二、酶的命名,（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:） 分开。如其中一个底物为水时，水可略去。,例1： 丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸,丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶,例2： 脂肪+H2O 脂酸+甘油,脂肪水解酶,3编号:,用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。,EC 大类.亚类.亚亚类.排号，如EC 3.4.17.1,3：水解酶 4：作用于肽键 17：金属羧基酶 1：排号,2习惯名称（recommended name）,（1）反应性质 如：水解酶、氧化酶、脱氢酶。,（2）底物，反应性质 如：蛋白水解酶。,（3）来源或其它特点 如：唾液淀粉水解酶,酶促反应：E + S = ES E + P 反应方向, 即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化H。 而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。 催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用,一、酶的催化作用 活化能,从初态转化为过渡态需要能量，即为活化能，活化能越大，中间产物越难形成，反应越难进行。,第三节酶的催化反应机理,反应过程中能的变化,在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。 E + S = E-S P + E 许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,二、中间产物学说,必需基团 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。,目 录,三、酶的活性中心,酶的活性中心,概念：酶的活性中心是指酶分子结构中，能与底物结合，并能催化底物转化为产物的具有特定空间结构的部位。 酶活性中心是酶分子中具有三维结构的区域，或为裂缝，或为凹陷，深入到酶分子内部，常为氨基酸残基的疏水基团组成的。,活性中心内的必需基团,位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。,活性中心外的必需基团,常见：His 咪唑基；Ser 羟基； Cys 巯基；Glu 羧基,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,目 录,(a)“三点结合”的催化理论,认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,四、诱导契合学说,（b）锁钥学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,刚性模式：Emil Fisher提出,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。,柔性学说：Koshland提出,C、诱导契合假说,酶原 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的不具有催化活性前体，此前体物质称为酶原。,酶原的激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。,五、酶原与酶原的激活,酶原的激活过程,胰蛋白酶原的激活过程,酶原激活的生理意义,避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。 有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,概念 研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。 影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂等。, 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,第四节酶促反应动力学,反应速度用单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示（单位：浓度/时间）,一、酶促反应速度的测定,测定酶反应速度应注意几点,（1）应使反应温度、pH、离子 强度和底物浓度等因素保持恒定。,（2）应使SE。,酶反应速度在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。 原因：A. 底物浓度下降，产物上升而加速逆反应。 B. 产物对酶的抑制， C. 酶在一定PH及温度下失活,所以研究酶的反应速度以酶促反应的 初速度为准。,1反应速度与酶浓度成正比,SE VE,二、酶浓度对酶反应速度的影响,2V与E 关系的几点讨论,1米氏方程的提出,三、底物浓度对酶反应速度的影响,第一步: E+S ES,中间复合物学说：,第二步: ESE+P,VES,1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程,S：底物浓度 V：不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度 m：米氏常数,当反应速度为最大反应速度一半时,Km值的推导,Km S, Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,. 米氏方程,（1）Vmax为最大反应速度,（2）当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = S 因此,米氏常数的单位为mol/L。,2、有关米氏方程说明几点,（4）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质 有关，与酶的浓度无关,（3） Km可近似表示酶对底物的亲和力； （ Km愈小，酶对底物的亲和力愈大）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都 有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该 酶的最适底物。,双倒数作图法,斜率=Km/Vmax,-1/Km,1/Vmax,3米氏常数的求法,将米氏方程改写成,四、温度的影响,一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度反应速度最大的温度。,最适温度它随底物的种类、浓度, 溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。,例: 反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。,1酶反应的最适pH： 酶表现最大活力时的pH,五. pH 的影响,酶的最适pH不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度; 酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。,例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时,s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0,2pH影响反应速度的原因,( 1 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。,( 2 ) pH影响了酶分子侧链上极性基团、底物分子解离状态。,（六）激活剂对酶反应速度的影响,什么是激活剂（activator）?,酶的激活剂,1. 无机离子,（1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。,（2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等,（3）氢离子,七、 抑制剂对酶活性的影响,使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。 能够引起酶的活性降低或丧失化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,抑制剂的作用方式,a. 不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。 酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易士气对巯基酶的抑制）两种。,b. 可逆抑制,抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类可逆抑制作用包括竞争性、非竞争性抑制几种类型。,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,(1) 竟争性抑制,竟争性抑制,(2) 非竟争性抑制,酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。,非竟争性抑制, 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物； 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同； 抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小； 动力学参数：Km值增大，Vm值不变。,竞争性抑制的特点,非竞争性抑制的特点： 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似； 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合； 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响； 动力学参数：Km值不变，Vm值降低。,一、酶的活力和活力单位 1、酶活力（即酶活性）: 指单位时间内酶催化某一化学反应的能力。 酶是否存在、含量多少，不直接用重量或体积表示，用酶活力表示。 酶活力的大小可用一定条件下酶催化一定化学反应的速度来表示， 速度大酶活力高，速度小酶活力低。,第五节 酶活力的测定,2酶的活力单位,酶活力单位: 一定条件下,在一定时间内将一定量的底物转化为产物所需酶量定为一个国际单位（IU）。 1个酶活力单位: 标准条件下,在1分钟内将1微摩（mol）底物转化为产物所需酶量 条件：温度25摄氏度,其它条件(PH及底物浓度)均采用最适条件。,酶的转换数kat 1972年国际酶学委员会又推荐一个新的酶活力单位，即kat单位 在最适条件下，1s内可使1mol底物转化为产物所需酶量定为1 kat 每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数为1 kat 1Kat=6107IU 1IU=16.67nKat,3酶的比活力 酶含量大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力单位（IU/mg蛋白质) 比活力 对同一种酶来说，比活力愈高，表示酶愈强。 总活力单位体积的酶活力(IU/ml)分离溶液总体积(ml),二、酶活力测定的两种方式,（1）终点法： 测定完成一定量反应所需要的时间。如液化淀粉酶活力的测定。,淀粉酶活力测定时、一定条件下，在待测的酶液中加入一定量的底物，测定此底物全部作用完或部分作用所需的的时间来计算酶活力。,淀粉酶活力测定时，从淀粉的用量、达到无色点所需的时间和样品稀释倍数就可以计算出酶的活力单位数。 例如：今有1g淀粉酶制剂，溶解在1000ml水中，从中取出0.5ml，与20ml2的淀粉溶液在30，PH6的条件下一起作用，10min后就与碘不起颜色反应，该酶制剂的活力单位按每1小时分解1g淀粉为1个单位（g/h=U）来计算，应为：,（3）酶活力测定的主要方法 化学滴定法、分光光度法、量气法、pH测定法、氧和过氧化氢的极谱测定、旋光法、色谱法、荧光法,（2）动力学法： 测定一定时间内酶催化的化学反应量。如蛋白酶活力测定。此法是常用的方式。,（1）淀粉酶：内切酶，从淀粉分子内部随机水解1，4糖苷键，但不水解1，6糖苷键，其最适PH为5-7，最适温度约40 。 （2）淀粉酶：外切酶，只能水解1，4糖苷键，不能水解1，6糖苷键。从淀粉分子的非还原性末端开始依次 切下一个个1，4麦芽糖苷键，并将切下的1，4麦芽糖转变成麦芽糖，所以称为淀粉酶。其最适PH为5-6，其热稳定性低于-淀粉酶。 （3）葡萄糖淀粉酶：外切酶，不仅水解1，4糖苷键，也能水解1，6糖苷键和1，3糖苷键。其最适PH为4-5，最适温度约40 60 。,第六节食品加工中重要的酶及应用,一 、 水解酶类,1、淀粉酶：催化淀粉和糖元水解的酶类。,2、纤维素酶 纤维素酶是指能水解纤维素-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶总称，它不是单一酶，而是起协同作用多组分酶系。 纤维素酶由葡聚糖内切酶（也称Cx酶）、葡聚糖外切酶（也称C1酶）、-葡萄糖苷酶（也称CB酶或纤维二糖酶）三个主要成分组成的诱导型复合酶系。C1酶和Cx酶主要溶解纤维素，CB酶主要将纤维二糖、纤维三糖转化为葡萄糖，当三个主要成分的活性比例适当时，就能协同作用完成对纤维素降解。,（4）异淀粉酶：产生于动植物及微生物中，是一种内切酶，从支链淀粉分子内部水解支点的1，6糖苷键。,3、脂肪水解酶,脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。脂肪水解酶是一种糖蛋白，其最适PH为偏碱性，最适温度约30 -40 。 特点 1）催化选择性强 2）“油脂-水”两相的界面发挥作用 应用 牛奶、奶酪、干果的加工中调控风味；皮革、绢纺等。,4. 果胶酯酶 1）果胶酯酶 果胶 聚半乳糖醛酸+甲醇 2）聚半乳糖醛酸酶 降解底物1，4糖苷键 3）果胶裂解酶 内切聚半乳糖醛酸裂解酶、外内切聚半乳糖醛酸裂解酶、内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶的总称 能把果胶酯酸分解为果胶酸和甲醇，它存在于霉菌、细菌和植物中，以柑桔类水果和蕃茄中含量为多。,5、蛋白酶,定义：催化蛋白质肽键水解的酶 按来源分为 1）动物蛋白酶 食品工业中应用少 2）植物蛋白酶： 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、 无花果蛋白酶。 常用于肉品和啤酒行业。 3）微生物蛋白酶 蛋白酶制剂的重要来源，用于产酶的菌种必须严 格选择。 应用范围包括：面包制作、肉品嫩化、啤酒制造、酿造等,固定化酶是将水溶性的酶连接到固相载体上， 使它以固相的状态作用于底物，因此也称固相酶。,四、固定化酶,主要采用 ：物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。,酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类，即载体结合法、交联法和包埋法。 载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。,酶的固定方法简介,物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。 离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。 共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。,交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。 包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型,交联法,包埋法,固定化酶的应用,总 结,酶是生物催化剂。生物体内的各种化学变化都在酶的催化下进行。 特点：催化效率高，具高度专一性，作用条件温和，但很不稳定。,酶是蛋白质，比其他催化剂脆弱。 酶蛋白决定酶反应的底物专一性及高效性。,动力学研究表明： 酶反映中存在有 ES 中间物, 催化作用的本质是酶，通过专一性结合的相互作用，而对于与受作用的底物所形成的过液态分子予以稳定，从而起到加速反应的作用。 米氏方程，米氏学论 给出了 Km、S及Vmax间的数易关系 一般测定酶活力选用如下的条件： 在最适 PH、最适温度、底物极大地过量（即SE）的条件下,测定酶反应的初速度。,一个酶的活力单位定义：25下，每分钟转变1ug分子底物的酶量。 比活力定义：每mg 酶蛋白所具有的酶活力单位数。 酶的可逆抑制中最重要的是: 竞争性抑制，可以通过加大底物浓度而得到逆转。 竞争性抑制剂的结构与底物十分类似，与底物争夺酶的活性中心。 非竞争性抑制剂_抑制剂与酶分子活性中心之外的重要基团（-SH）作用而造成的抑制。 不可逆抑制剂_使酶分子中一些重要基团发生特大的、不可逆的变化。,酶反应速度极高的原因5个方面，其中最主要的是： a. 酶与底物结合时，两者构象的改变使它们相互契合。 b. 底物分子适当地向酶分子活性中心靠近。 c. 底物趋向于酶的催化部位。 d. 活性中心这一局部地区的底物浓度大大增高。 e. 底物分子发生扭曲，易于断裂。 使酶反应速度增高的其它因素： a 酶与底物形成有一定稳定度的过度态中间物 _共价的ES 中间物迅速分解成产物 b 酶活性中心的质子供体和质子受体对底物分子 进行了广义的酸碱催化,生物体中对酶活性有四种类型的调控作用： 1 别构相互作用的调控 2 可逆共价修饰的调控 3 酶质的激活（即不可逆共价修饰的调控） 4 激促蛋白质or抑制蛋白质的调控 别构酶一般催化多酶体系的第一步反应，也受反应系列的最终产物抑制。 最终产物可以非共价的结合到别构中心（又称调节中心）上，然后别构酶再调节多酶体系的反应速度。,别构酶表现出非典型性的动力学特征： 不符和米氏公式，表现出V-S的S形曲线 当其他酶对共价调节酶进行共价修饰时（指可逆共价修饰的调控中的酶），这种调节酶能在非活性形式及活性形式之间相互转变。,_是一类具多个亚基的酶（别构 酶），在代谢中很有意义。 _能催化同一种化学反应，但其酶分子