[理学]黄牛mtDNA cytB进化分析-综合实验.ppt

中国黄牛mtDNA cyt b基因 分子进化分析,文献研究分析引入 本实验流程介绍 实验要求,文献研究分析引入,本实验流程介绍,黄牛血样/组织样品的采集 DNA样品的制备及检测 引物(primers)设计：primer primer5.0 PCR反应液制备 PCR反应及PCR产物检测 PCR产物的凝胶回收(产物不好的情况下) DNA序列测定 DNA序列的进化分析,黄牛血样的采集,颈静脉采血/尾静脉采血 准备物品：灭菌的5-10ml管、灭菌针头18号、剪毛剪、酒精棉球75%、抗凝剂（肝素/EDTA/ACD）,DNA样品的制备及检测,PBS缓冲液洗3次，12 000 r/m离心10 min (4)，至沉淀呈淡黄色 加入DNA抽提缓冲液，混匀，37水浴1 h 蛋白酶K，混匀，55过夜至澄清 反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚，混匀20min；4，12000 r/m离心10 min，取上清；重复1次 加氯仿，混匀20min，4，12000 r/m离心10 min，取上清；重复1次 加氯仿和异戊醇混合液，混匀20min，4，12000 r/m离心10 min，取上清； 加NaAc缓冲液及冰冷的无水乙醇，混合转动出现浑浊到白色絮状沉淀， -20保存30 min60 min； 4，12000 r/m离心10 min，弃上清液， 70%的冷乙醇漂洗DNA沉淀2次； 4，12000 r/m离心10 min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净，约34 h； DNA溶于80100 L的TE液，4保存直至DNA完全溶解。,引物(primers)设计：primer primer5.0,扩增引物： 正 链引物L14724B： 5-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3; 反链引物H15915R： 5-GGAATTCATCTCTCCCGGTTTACAAGAC-3。 测序引物：L15408：5-ATAGACAAAATCCCATTCCA-3。 同学自己可以从NCBI中的GenBank中下载自己感兴趣的基因设计引物，也可以利用NCBI的在线引物设计软件。Just try！,PCR反应液制备与反应,ddH2O 10.2L Primer1 0.5L Primer2 0.5L Golden Easy Polymerase 0.3U 2Reaction Mix 12.5L DNA Template 1.0L,PCR反应程序： 94 预变性4 min 94 变性30 s 5 退火30 s 72 延伸1 min （循环30-35次） 72 充分延伸7 min 4 保存,Bio-Rad的MyCycler,PCR产物检测-琼脂糖凝胶电泳法,1.0%琼脂糖凝胶电泳 原理：片段大小不同的DNA片段在琼脂凝胶中沿负极向正极运动，其电泳速率不同。,制作： 称取适量的琼脂糖粉0.2g，量取25ml电泳缓冲液（0.5-1.0TBE），混匀；电热套上加热至沸腾至均匀；拿出凉至约60 （手背感觉不太烫），加1.0LEB溶液，混匀；迅速倒入胶槽（如有气泡将气泡赶出）；凝固约30min，点样，80-100V电泳约1h。凝胶成像系统拍照。,Marker 已知大小的DNA片段或蛋白质，在相同的条件下电泳，这些片段可以作为参照物来计算位置片段的大小。,DNA序列测定及分析,得到PCR产物后将其送到公司序列测定,序列分析可以用很多软件，如Clustal、MEGA、DNAStar等。 该部分分析工作希望大家自己完成，提供相关文献、软件、说明书；大家可以相互一起研究软件的使用，可以借助Internet。,实验要求,注意安全 必须