《DNA甲基化》PPT课件.ppt

DNA methylation,2010. 1.20,刘 丹,2,明星熊猫“滚滚”,为什么熊猫是黑白的？, 基因决定命运,1942年，Conrad Hal Waddington 提出表观遗传学( Epigenetics)的概念，以此解释物种的内在基因与外观表现之间的关系。 基因序列(Genotype)的改变可能导致功能及表型(Phenotype)的改变。 基因型通过一些“偶然的、不确定的机制”决定了不同的表型。 生物的不同特征完全随机获得,Waddingtons epigenetics,基因型,表型,Waddingtons epigenetics,基因型,表型,DNA双螺旋,基因的结构,基因表达受多种因素调控,现代表观遗传学 概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型 生物的不同特征由基因定向调控 表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）： DNA甲基化 表观遗传学的核心（最初始的调控方式） 组蛋白修饰 MicroRNA Genomic imprinting,真核生物基因表达调控层次： 1、DNA水平调节 2、转录水平调节 3、转录后水平的调节 4、翻译水平调节 5、翻译后加工的调节,DNA,转录初产物RNA,mRNA,蛋白质前体,mRNA降解物,活性蛋白质,DNA水平调节,转录水平调节,转录后水平的调节,翻译调节,mRNA降解的调节,翻译后加工的调节,核,细胞质,DNA甲基化,DNA methylation的定义,DNA methylation是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA 合成后的修饰作用,是调节基因表达的机理之一。 DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。,DNA methylation的定义,在甲基转移酶（DMNT）的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶（Cytosine）被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），这常见于基因的5-CG-3序列,DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）,结构基因中广泛存在着相邻的两个CG，其中胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构（CpG）,CpG 岛（cpg island） 结构基因组中70% 90% 的独立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 岛 主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60以上基因的启动子含有CpG岛。 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点,CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 基因表达的调控开关,DNA methylation的生物学功能,在发育和分化中调控基因的表达； 特征性表型基因的表达（肤色、毛发） X染色体的失活（X-inactivation ）,DNA甲基化生物学作用,IAP: intracisternal A particle 去甲基化：灰鼠基因（agouti）仅微量表达 甲基化：基因超量表达,X染色体的失活（X-inactivation ） 生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活性的现象。 避免因拥有两条X染色体而产生 双倍的基因产物，保持和雄性动物 X染色体数量及功能上的一致性。,X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。核心区命名位X染色体失活中心（X-chormosome inactivation center，Xic），其定位在人Xq13区（Barr氏小体浓缩部位）。 研究发现失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因转录处于关闭状态。,X-chromosome inactivation,雌性家猫的一条X染色体完全失去活性,Rainbow,Copy Cat,Allie,X染色体失活,影响DNA methylation的调控因素,DNA 甲基转移酶(DNMT)的活性 哺乳动物体内有三种DNA 甲基化转移酶：Dnmt1、Dnmt3a 和Dnmt3b。 DNMT1- 持续性DNA 甲基转移酶；与甲基化相关，缺乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形 DNMT3a、DNMT3b- 从头甲基转移酶；与去甲基化相关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达,SCIENCE VOL 300 18 APRIL 2003,正常小鼠 (Dnmt1 +/+) 阳性对照 DNM1酶缺乏小鼠模型 (Dnmt1 chip/) 实验组 Embryonic stem (ES) 细胞 (Dnmt1 /) 阴性对照,Dnmt1 chip/小鼠Dnmt1酶的表达量明显减少，大约为正常小鼠的10%,Dnmt1 chip/小鼠体重仅为正常小鼠66% 80%的小鼠在4-8个月内产生T细胞性淋巴瘤,c-myc癌基因在Dnmt1 chip/小鼠中异常高表达,影响DNA methylation的调控因素,组蛋白的甲基化 真核生物的组蛋白N 末端或C 末端氨基酸残基可生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰，并影响基因转录。 H3K9 的甲基化与DNA 的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用 H3K4 的甲基化拮抗DNA 甲基化所产生的基因沉默,影响DNA methylation的调控因素,RNA 干扰 一般认为RNA 干扰( RNAi) 是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象 翻译、转录后水平 siRNA 指导DNA 甲基化(RdDM) 现象证实：siRNA 可以通过DNA 甲基转移酶Dnmt1和Dnmt3b介导DNA 甲基化 DNA水平,DNA methylation and Oncology,正常生物DNA甲基化,DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞分化发育，基因组DNA经历了去甲基化、区域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性的去甲基化的过程。最后，这种DNA甲基化模式就相对稳定下来。,肿瘤组织的DNA甲基化,肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。 低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤 在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下,DNA甲基化与肿瘤的关系,肿瘤细胞的特征： 癌基因低甲基化 被激活； 抑癌基因高甲基化 被沉默 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚,常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用,有学者研究认为,DNA甲基化是继基因结构变异即突变和缺失之后的第3种抑癌基因失活机制。 CpG岛保护因子缺乏 DNMT3高表达和DNMT复合体调控障碍 复制周期时间错误 DNA甲基化导致遗传不稳定性。,Milutinovic S, DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAF1/CIP1/ sdi1) J . J Biol Chem, 2000, 275 (9) : 6 353 - 6 359.,DNA methylation的应用前景,肿瘤的早期诊断 基因启动子区域的CpG岛甲基化能沉默基因转录，在正常细胞中是一种调节基因表达的手段。然而抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达,DNA methylation的应用前景,DNA methylation的应用前景,Kuester 报道在88.19% ( 24 /27 ) 食管Barretts化生病例和100% (13 /13)的上皮内瘤变病例中检测到MGMT基因异常甲基化，提示MGMT甲基化是食管腺癌早期频繁发生的事件。 Kelavkar 等发现ALDX15基因在前列腺上皮内瘤变、前列腺癌中以异常甲基化存在；而在正常前列腺细胞系中是以非甲基化状态存在，说明其异常甲基化与前列腺癌的发生关系密切。,1.KUESTER D, et al. Silencing of MGMT expression by promoter hypermethylation in the metap lasia -dysp lasia - carcinoma sequence of Barretts esophagus. CancerLett, 2009, 275 (1) : 117 - 126. 2.KELAVKAR P, et al. DNA methylation paradigm shift: 15 - Lipoxygenase - 1 up regulation in p rostatic intraep ithelial neop lasia and p rostate cancer by atyp ical p romoter hypermethylation. Prostaglandins Other Lip id Mediat,2007, 82 (1 - 4) : 185 - 197.,DNA methylation的应用前景,优点：DNA甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本） 缺点：特异性不足,DNA methylation的应用前景,肿瘤的预后分析 甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。 RASSF1A甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常见 在结直肠癌Dukes分期C和D 的病例中CDKN2A, p16 的甲基化率比A 和B 期的增高,DAS PM, DNA methylation and cancer. J ClinOncol, 2004, 22 (22) : 4 632 - 4 642,DNA methylation的应用前景,DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移 乳腺癌中Cyclin D2, RAR - , Twist, RASSF1A和H IN - 1的甲基化改变与淋巴结、骨、脑、肺转移有关,MEHROTRA J, et al. Very high frequency of hypermethylated genes in breast cancermetastasis to the bone, brain, and lung . Clin Cancer Res, 2004, 10 ( 9 ) :3 104 - 3 109.,DNA methylation的应用前景,甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。 口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患者复发率明显增高 甲基化影响生存期 膀胱癌中APC, GSTP1和TIG1基因发生异常甲基化时,患者存活时间明显缩短,LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene p redicts poor p rognosis in oral squamous cell carcinomas J . Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058. ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cel - Free Serum DNA IndicatesWorse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.,DNA methylation的应用前景,肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化） 抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望,胞苷类似物通过共价键与DNMT形成不可逆的复合物从而竞争性抑