病原生物学实验.ppt

Please attention!,1.您进入实验室时，请穿着白大衣以保护自身安全！ 2.本实验课需要显微镜，请您携带学生证去四楼显微镜室领取！ 3.请您不要随意触碰实验用品，以免发生意外！,张文钰 病原生物学与免疫学教研室 ,实验一 （5学时）,一、实验室生物安全,熟悉 （1）微生物学实验室生物安全意义 （2）实验室规则,2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。 2010年12月，东北农业大学28名师生在“羊活体解剖学实验课”中感染布鲁氏菌病。2011年6月，东北农业大学免去该校动物医学院院长和党支书职务。感染病菌的学生称，羊没有被检疫，被染病的羊那天被几个班级的学生重复使用。,感染的主要原因是： 防护意识不强； 操作失误，防护条件不足。,P3实验室,病原生物学实验室规则,学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒。 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内。 严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。 实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。,实验室意外紧急处理办法,1 皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%碘酊或2%红汞涂抹。 2 烧伤：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。 3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%硼酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡12滴滴眼）。 4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，1：1000高锰酸钾或3%双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。 5 菌液污染台面：2%3%来苏尔或0.1%新洁尔灭覆盖30分钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3分后肥皂和清水洗净。 6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。,二、无菌操作技术,实验目的 1 掌握常用的细菌接种方法 2 熟悉细菌生长现象的观察方法,（一）细菌的分离培养和接种技术,接种工具 接种针和接种环 L型玻璃棒 接种环境 接种罩、超净工作台或无菌室内进行。,接种方法,1.平板划线接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量较少的标本。,分区划线,划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂. 第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/41/5. 划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划线不能交叉重复. 每次划完后应灭菌.,连续划线法,2.斜面接种法： 用于菌种移种，以进一步鉴定 和保存菌种。,3.半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。 4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基 的接种。,将上述已接种细菌的培养基置37恒温培养箱中孵育1824h，观察细菌的生长现象。,（二）细菌在培养基上的生长现象,1.细菌在固体培养基中的生长现象,菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌落与菌苔,菌落,菌苔,2.细菌在液体培养基中的生长现象,混浊：大多数细菌 沉淀：多见于链状排列的细菌。 菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆菌） 。,细菌在液体培养基中的生长现象,菌膜,菌沉淀,均匀浑浊,对照,3.细菌在半固体培养基中的生长现象,有鞭毛细菌： 在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌： 只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。,细菌在半固体培养基中的生长现象,有动力 现象,无动力 现象,三、细菌的形态学检查 形态学检查分类 一、不染色标本检查(活体） 悬滴法 压滴法 二、染色标本检查 单染法：简单染色，一种染料 （美兰染色） 复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、抗酸染色）,革兰染色(Gram stain) 1884年由丹麦医师Gram创立 革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具有非常重要的意义.,目的：,1、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法 2、熟悉革兰染色的原理和临床意义,1、通透性学说 2、等电点学说 3、化学学说,原理：,通透性学说,G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易脱除染料。 G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易脱除染料。,等电点学说,G+菌等电点（pI23） G-菌等电点（pI45） 在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。,化学学说,G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色 G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色,器材和试剂： 1、菌种 金黄色色葡萄球菌 大肠杆菌 2、试剂 革兰染色液 初染液 结晶紫 媒染液 卢戈氏碘液 脱色液 95%乙醇 复染液 稀释石碳酸复红 3、其它 接种环 载玻片 染色盘 洗液瓶 酒精灯等,冲洗,染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果,方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色 （95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸 吸干,1min,1min,30s,30s,冲洗,冲洗,冲洗,一 一 半 半,G+菌,G-菌,结晶紫,卢戈氏碘液,95%乙醇,石碳酸复红,初染 媒染 脱色 复染,结果,图一,图二,无菌操作（接种环灭菌和取菌） 涂片的厚度要适中 染色的时间控制，一一半半 冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗 观察后将玻片放入玻片缸中,注意事项,意义,1.鉴别细菌,2.研究与致病性的 关系,3.指导临床用药,G+,G-,G+ 致病 外毒素,G- 致病 内毒素,G+ 青霉素、头孢菌素等,G- 链霉素、庆大霉素等,细菌的特殊结构（示教） （二毛荚一胞）,从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。 功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H抗原）,菌毛比鞭毛更更细、短、直、硬和多的丝状蛋白附属物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛。 功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质。,细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度0.2m边界明显者称为荚膜，厚度0.2m者称为微荚膜。 功能：荚膜护菌强致病-抗吞噬作用、抗有害物质损伤、抗干燥作用、黏附作用。,菌体内部物质缩水（60）形成圆或卵圆形小体。 功能：芽胞形态辨细菌， 灭菌标准抗力强。,芽胞,油镜的使用方法 寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。 增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大。 转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。,调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加油区之外重找时应按：低倍高倍油镜程序。在加油区内重找应按：低倍油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。 清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯