[自然科学]干扰素的生产与行.ppt

干扰素的生产工艺 与市场分析,主要内容,1 干扰素简介 2 干扰素生产工艺的发展 3 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺 4 国内基因工程药物产业发展状况 5 干扰素制品国内市场的现状与发展分析,1 干扰素简介,1. 1 干扰素的定义 干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称Interferon，简称IFN。,1b,1.2 干扰素的发现,干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。,1.3 天然干扰素的分类,1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素：IFN、IFN、IFN 、IFN 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素（IFN) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节,提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。,上市重组干扰素: 2a、2b、1b、 1b， 1992年我国第一个基因工程药物IFN-1b获得国家一类新药证书。 研发中的重组干扰素：IFN ，临床阶段,2a,2b,1.4 干扰素的作用机制,干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。抗病毒蛋白主要包括2-5A合成酶和蛋白激酶等。前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，使病毒复制终止。,间接性：通过诱导细胞产生抗病毒蛋白等效应分子抑制病毒。 广谱性：抗病毒蛋白是一类酶类，作用无特异性。对多数病毒均有一定抑制作用。 种属特异性：一般在同种细胞中活性高，对异种细胞无活性。 发挥作用迅速：干扰素既能中断受染细胞的病毒感染又能限制病毒扩散。在感染的起始阶段，体液免疫和细胞免疫发生作用之前，干扰素发挥重要作用。,不同来源的干扰素,1.5 重组干扰素的临床应用,广谱抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFN） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN） 多发性硬化症 rhuIFN,1.6 干扰素适应症,目前使用干扰素治疗的主要对象是慢性乙型和丙型肝炎的病人，而且在乙型肝炎病人中，有以下情况应用干扰素治疗反应较好 1.治疗前血清ALT或AST有反复波动或酶的活力持续升高者； 2.治疗前血清HBeAg的P/N值偏低(P/N 58)或HBV DNA水平低(100Pg/ml)者； 3.病程较短者； 4.肝脏病理有活动性炎症病变(如有碎屑样坏死)者疗效佳；,5.无重叠感染者(如丙型、丁型肝炎等)； 6.无HIV感染或免疫抑制剂治疗者； 7 肝组织内含铁量低者； 8.治疗期间血清中无干扰素中和抗体产生者 9.女性患者疗效比男性为佳。,2 干扰素生产工艺的发展,干扰素生产工艺路线（1）,体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞 1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市 产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性,干扰素生产工艺路线（2）,人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN -n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。,干扰素生产工艺路线（3）,上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:,干扰素生产工艺路线（4）,上市产品：rhuIFN -1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格,动物无限细胞系培养生产工艺：,干扰素生产工艺路线（5）,宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida） 上市产品：IFN -2b/安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性 工艺特点： 发酵周期短：几个小时 无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析,基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺,3 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺,3.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立,第一步：干扰素-2b基因的克隆 第二步：表达载体的构建 第三步：工程菌的构建,第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR),制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR， 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,第二步：表达载体构建, IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体,第三步：工程菌构建,转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种,3.2 干扰素-2b的发酵工艺过程,（1） 摇瓶培养,取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30，pH7.0，250 r/min，182h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。,（2）种子罐培养,接种：接入50L种子罐，接种量10%。 培养：30，pH7.0。 控制：级联调节通气量和搅拌转速 DO为30%，34h，OD4.0。 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。,（3）发酵罐培养,接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。 控制：级联调节通气量和搅拌转速。 前4h：30，pH7.0，DO为30%。 4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。 终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。 检测：发酵液杂菌检查,（4）菌体收集,连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：20冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。,3.3 干扰素的分离纯化工艺过程,3.3.1、干扰素分离工艺过程 3.3.2、干扰素的纯化工艺过程,3.3.1 干扰素-2b分离工艺过程,菌体裂解 预处理 初级分离,(1)菌体裂解,裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎20菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。,(2)预处理-沉淀,加絮凝剂聚乙烯亚胺: 210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液: 210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。,(3)离心,连续流离心机：210，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。,（4）初级分离,盐析: 4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。,3.3.2、干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装,(1) 溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解：210，匀浆，完全溶解。,(2) 沉淀与疏水层析,等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）,等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。,(3)阴离子交换层析与浓缩,0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。 盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱， 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。,（4）阳离子交换层析与浓缩,用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。,(5)凝胶过滤层析,洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分,(6)无菌过滤分装,0.22 m滤膜过滤干扰素溶液 分装 20以下的冰箱中保存。,(7)检测项目,干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素,4 国内基因工程药物产业发展状况,我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。 一种新药从研发到投放市场，投入大约为30亿60亿美元。,存在的问题： （1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严重影响产业的健康发展。 （2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。,5 干扰素制品国内市场的现状与发展分析,2006年-2009年我国干扰素需求量统计 单位：千克,需求量及其增长分析 自1957年发现干扰素以来，40年来的研究使人们对干扰素的认识已有了根本改观，干扰素不仅是病毒间干扰现象的介质，而且是调节细胞功能的重要系统，现在已发展成为与病毒学、细胞学、免疫学、临床医学、分子生物学以及肿瘤学有关的一个新兴的研究领域，随着生物工程技术的兴起，目前已广泛进入临床应用时代。,我国干扰素区域市场需求分析,我国干扰素产品结构分析,干扰素按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组-干扰素和人自然干扰素两大类。从我国市场研发情况来看，目前重组-干扰素占据的市场比重较大，约为67.4%。,产量及其增长分析,2006年-2009年我国干扰素产量统计 单位：千克,近几年我国干扰素市场一直处于供不应求的局面。,前景与展望 随着人们对干扰素研究的不