杂草抗药性检测技术.doc

杂草抗（耐）药性检测技术1. 1 整株水平测定 整株植物测定法。一般所使用的方法为Ryan法 (1970) , 该法简便易行。具体方法为: 首先从怀疑有抗药性杂草生物型和从未使用过除草剂的田块采集杂草种子, 按小区大田播种或温室盆栽, 在播后芽前或苗后进行常规施药处理。药剂设置不同浓度梯度, 通过测定不同剂量下杂草的出苗率、死亡率、叶面积、鲜重、干重等指标, 与对照比较, 以确定抗药性水平。盆栽试验能够提供杂草交互抗性或多抗性方面的信息, 可以指导轮换用药,但是这种方法无法确定抗药性产生的原因和机理等问题, 且费时长, 但技术简单易行, 大批量植株可同时进行, 且重复性较好, 因而是抗药性检测的常用方法。幼苗检测法。具体方法是: 在玻璃试管中放置湿润的滤纸, 把种子摆放在滤纸上, 然后将试管放到盛有营养液 ( 不含药剂) 的培养皿中, 通过滤纸吸取营养液, 种子在滤纸上发芽,一段时间后, 把带根 (长35mm) 的种子转移到封闭的瓶中滤纸上, 将不同浓度的药剂溶液加到瓶中, 在一定条件下培养, 通过测量芽长或胚芽鞘的长度测定杂草的抗药性水平。1. 2 器官或组织水平测定 根据杂草对除草剂产生的局部反应, 抗药性杂草往往会在组织或器官的形态结构上表现出差异性, 测定这种差异便可以鉴定抗药性。 培养皿种子检测法。这种方法是把催芽的杂草种子放在加入药剂的琼脂平面或浸药的滤纸上培养, 通过测定发芽率、主根长、鲜重或干重等指标鉴定抗药性。此法相对快速、廉价、可靠, 尤其是对大量杂草种群的常规抗药性检测非常重要。如, Letouze A等 ( 1997) 、MossSR等 ( 1999) 建立的用以检测禾本科杂草抗药性的方法。 分蘖检测法。把种子种植在粗沙和泥炭( 体积之比13) 的混合物中, 在温室内培养。选取3叶期 ( 第3叶未充分展开) 正生长的分蘖,小心地除去根, 把分蘖放在高浓度的药剂溶液中, 一段时间后, 通过比较第3叶坏死程度来评价杂草的抗药性水平。叶圆片浸渍技术测定法。首先将健康的叶片用打孔器打取相同面积的叶圆片, 将叶圆片浸渍在含有一定浓度除草剂的磷酸缓冲溶液的试管中, 抽真空, 小圆片下沉至试管底部, 解除真空, 加入少量NaHCO3溶液, 照光, 对除草剂不敏感或产生抗药性的生物型, 光合作用未被抑制, 组织间产生足够多的O2, 叶圆片上浮;而对除草剂敏感的生物型, 光合作用受抑制,不能产生足够多的O2, 圆片仍沉在试管底部。此法可鉴定对抑制光合作用的除草剂产生抗性的生物型。花粉粒萌发法。按分蘖检测法所示种植杂草。剪取具花药的刚从颖片抽出的穗,转移到盛水的烧杯中, 放在距冷光20cm的地方,诱导释放花粉, 把花粉震落到0.25%含系列浓度药剂的固体琼脂培养基上。一定条件下培养一段时间后, 用显微镜 (200倍) 观察花粉萌发情况。萌发花粉计数以花粉管长度至少达半个花粉粒长度为准。该法可对田间正在生长的杂草实现快速抗药性检测。茎切面再生苗测定法。温室或者大田常规处理, 一般采用盆栽法, 当杂草生长至3叶1心期, 用一定剂量的除草剂茎叶处理, 一定时间后 ( 视除草剂吸收情况) 沿第2叶部位切除上部植株, 通过测定再生的茎段长度检测杂草抗药性。此法可用于禾本科杂草对内吸传导型除草剂的抗性检测鉴定。此外, 切片、压片技术结合电镜技术, 通过观察形态学变化亦可检测鉴定除草剂抗性生物型, 常用组织的石蜡切片、根尖、茎尖、花粉母细胞的压片等。1. 3 细胞或细胞器水平测定 叶片叶绿素荧光测定法。荧光反应被称为光合作用的探针。当用光合作用抑制剂, 如取代脲类、三氮苯类或脲嘧啶类, 处理植物叶片时, 光合作用抑制剂阻断电子由QA到QB的传递, 光系统II的还原端被中断, 捕获的光能不能往下传递, 叶绿素a处于激发态, 以荧光的方式释放能量, 通过测定叶绿素a发射荧光的强弱可以检测抗药性。方法有Tucruet、 Gasguea 氏 法 和 Ahrens 法 。 Tucruet、Gasguea氏法是在清晨采取植物幼叶, 黑暗条件下浸于除草剂水溶液中, 2h后取出, 用短波光照射叶片 背 面 , 测 定 叶 片 发 出 的 荧 光 强 度 ;Ahrens法是从清晨采取的幼叶上切取叶圆片, 光照的条件下悬浮于去离子水2060min, 取出并吸干上面的水, 正面朝上放在黑布上, 黑暗条件下测定其荧光强度, 后将叶圆片面朝下, 放入含有表面活性剂和除草剂的溶液中, 照光后测定荧光强度。离体叶绿体测定技术。光合作用抑制剂抗性生物型的类囊体膜上的光系统II组分发生了改变, 导致电子传递的变化, 从而造成叶绿体的光还原反应能力下降, 通过测定希尔反应或荧光反应, 可以检测杂草的抗药性。酶解法提取叶绿体。希尔反应测定技术是将提取的叶绿体放入含有氧化剂 ( DCPIC) 的希尔反应介质中,叶绿体在光照下放出氧气, 并将氧化剂还原。荧光反应测定技术是通过测定叶片中荧光强度来鉴定光系统II的功能。叶绿体荧光测定须在黑暗中进行。用蓝色闪光照射叶绿体悬浮液, 叶绿素发射荧光, 用光电极管测定发射的荧光。此外, 还可以通过测定叶绿素含量的变化检测抗药性。光合速率测定法。光合作用抑制剂杂草抗性生物型在处理后其光合速率变化不大, 而敏感生物型的则受到严重抑制。通过测定光合速率的诱导变化研究光合作用抑制剂对植物或叶片的影响, 可以检测鉴定杂草抗药性, 主要方法有: 红外线CO2测定法、氧电极测定法、pH比色法、气流测定法、改进的干重测定法和半叶法等。呼吸速率测定法。抑制呼吸作用的除草剂不多, 如五氯酚钠、二硝酚、二乐酚、碘苯腈、溴苯腈、敌稗、氯苯胺等。测定方法可参照光合速率测定法。1. 4 分子水平测定 对于作用靶标已明确的除草剂, 可通过测定靶标酶或与靶标酶催化的反应存在密切关联的酶的活性差异或某些代谢物质量的差异判断杂草抗药性; 对于已经获知编码基因的除草剂靶标酶, 可使用DNA分析技术判断杂草的抗药性。通过测定ALS ( 乙酰乳酸合成酶) 的活性判断杂草对ALS抑制剂的抗性, 测定ACCase ( 乙酰辅酶A羧化酶) 的活性判断杂草对ACCase抑制剂的抗性, 内野彰根建立了通过测定ALS蓄积量判断母草属等水田杂草对磺酰脲类除草剂抗性的快速鉴定方法。叶圆片亚硝酸还原酶活性测定法。抑制光合作用的除草剂能导致植物绿色组织中亚硝酸还原酶的活性下降, 亚硝酸浓度增加, 同时还使光系统II中的电子载体部位受到抑制, 根据组织中亚硝酸还原酶的活性可鉴定抑制光合作用的除草剂抗性生物型。酶联免疫测定 ( ELISA) 法和DNA分析技术。酶联免疫法 酶联免疫法 ( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 始于 20 世纪 70年代，是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面。测定时，将受检样品和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物。反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，其量与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。2002 年 Reade 等建立了田间酶联免疫测定看麦娘谷胱甘肽 S 转移酶( GSTs) 丰度检测看麦娘对绿麦隆、异丙隆和精口恶唑禾草灵抗药性的技术。1 4 2 DNA( 或 RNA) 分析法 对于已经获知编码基因的除草剂靶标酶，可使用 DNA( 或 RNA) 分析方法判断杂草的抗药性。该法通常先提取基因组总 DNA( 或 RNA) ，再进行 PCR 扩增，然后对克隆的PCR 产物进行测序，通过序列同源性分析便可检测杂草的抗药性。2008 年 Corbett 等利用 PCR RFLP方法成功鉴定了抗性苋属杂草体内乙酰羟基酸合成酶( AHAS) 的 4 处突变位点。2009 年卢宗志等采用 PCR 技术，分别对抗药性和敏感性雨久花生物型的 ALS 基因片段进行扩增和基因克隆，并对获得的 DNA 序列片断进行测序比对，与敏感性雨久花生物型 ALS 相比，抗药性雨久花生物型的 ALS 基因共有 3 处发生突变。运用ELISA法制备与杂草抗药性有关的某些关键酶的单克隆抗体, 通过酶的级联放大作用,可以专一、灵敏、微量、简便、快速地检测杂草的抗药性。运用RAPD指纹图谱的变化检测杂草的抗药性变异体。随着杂草抗药性机理研究的不断深入, 这些技术已越来越多地应用于快速检测体系中。趋势：一套抗药性快速检测鉴定体系是发展的趋势。培养皿种子检测法的改进。A Cirujeda等(2001) 建立的通过在琼脂培养基中加入赤霉酸GA3打破种子休眠快速检测鉴定虞美人对苯磺隆抗性的方法。高通量检测鉴定。高效活体鉴定法: 在多孔板的每个微孔中注入琼脂糖培养基 ( 含某一剂量药剂) , 将杂草种子放入微孔中。测试板封好放入生化培养箱, 在合适的条件下培养7d,然后对植物的化学损伤和症状进行评价。离体细胞悬浮培养鉴定: 检测时, 药剂溶于丙酮后注入试管中, 再加入对数期的细胞悬液, 试管放在400r/min摇床上于25黑暗中培养8d, 然后用微电极测培养基的电导率, 电导率的减少与细胞生长量的增加成反比, 结果以相对于对照组的生长抑制率表示。离体酶鉴定法: 目前发现的除草剂靶标酶主要有乙酰乳酸合成酶(Acetolactatesynthase,AIS)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoAcarboxylase,ACCase)、原卟啉原氧化酶(Protox)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthase.GS)、5- 烯醇丙酮酸莽草酸-3- 磷酸合成酶 (EPSPS) 等十几种。基于这些靶标酶建立起各种特异的鉴定模型, 利用比色法、放射性标记法等检测手段评价测试系统的反应。免疫鉴定法: 这种方法最早开始于20世纪60年代, 其原理是利用了活的生物体对外来物质的自然反应, 即抗原- 抗体反应。有些杂草抗药性是由靶标酶编码基因的点突变引起的, 检测这些突变位点就可以检测杂草的抗药性, 结合PCR技术可以实现大批量杂草的快速抗药性检测。这方面的方法有: 专一性等位基因PCR扩增、PCR单链构象多态性、固相微测序反应、限制性片段长度多态性、PCR寡核苷酸探针斑点杂交、随机扩增多态性DNA、Northern斑点杂交、固定化人工膜高效液相色谱等。抗草甘膦杂草的鉴定方法2.1整株水平测定2.1.1整株植物测定法 整株植物测定法简单易行，重复性好，是检测杂草对除草剂是否产生抗性最为普遍的方法。将疑似对草甘膦产生抗性的杂草种子盆栽，在温室设置适宜杂草生长的条件培养。禾本科杂草一般培养到叶期，阔叶及莎草科杂草根据杂草本身条件而定，培养到适合称取生物量为宜。设置不同剂量处理杂草，草甘膦剂量不少于个，周后称其鲜重、干重等指标，运用回归模型计算出抗药性水平。整株植物法由于准确度高而被广泛用于检测杂草对草甘膦抗药性，目前发现的每种抗草甘膦杂草都用过此种方法，但此法需要较长的时间，并要求足够量的重复以确保结果的准确性。2.1.2培养皿检测法 培养皿法较整株植物测定法快速、简便。已经成功应用于检测杂草对除草剂的抗药性。在培养皿中加入滤纸，将不同浓度梯度草甘膦加入培养皿，草甘膦剂量一般设置个，药剂均匀浸湿滤纸，再将杂草种子放入培养皿，在培养箱中培养10左右，通过测定发芽率、根长等指标，计算其抗性水平。由于不同杂草的种子大小、发芽特性不同，该方法的应用有一定局限性。一般应用于禾本科杂草对除草剂的抗药性检测。培养皿法检测抗药性的准确性较差，用此种方法测得的杂草对草甘膦的抗药性水平一般高于整株植物法。2.1.3症状指数法草甘膦处理杂草后，会表现出褪色、黄化、叶片卷曲等症状，按照症状严重程度将其分为个级别（表）。将杂草种子盆栽培养到一定生长阶段，用不同浓度梯度草甘膦处理，当不同处理杂草表现出的症状差异明显时记录其症状级别。利用曲线回归模型计算，确定杂草对草甘膦的抗性水平。吴加军等用此方法测定了我国小白酒草对草甘膦的敏感程度，重复性较好。症状指数法也有局限性，由于症状级别无明显界限而且各种杂草受草甘膦处理后表现出的症状也有差别，因此划分症状级别时有一定主观性。2.2生物化学测定法2.2.1莽草酸法草甘膦处理植株后，会引起敏感植株体内莽草酸大量积累，而耐草甘膦转基因作物与抗草甘膦杂草体内莽草酸的积累量则明显低于敏感植株。发现草甘膦处理的油菜体内莽草酸的积累量与草甘膦剂量成正比关系，并用模型算出了草甘膦对油菜的。也尝试将不同剂量草甘膦处理杂草，从杂草叶片中检测莽草酸含量，并算得几种杂草对草甘膦的。莽草酸法在草甘膦喷药后几天便会检测出结果，而且不需要大量的重复。利用莽草酸法成功检测出美国俄勒冈州抗草甘膦的多花黑麦草。2.2.2其他检测方法烯醇丙酮莽草酸磷酸合成酶（）是草甘膦的靶标酶，硬直黑麦草等部分抗性杂草体内在草甘膦处理之后活性增高，这种方法检测草甘膦抗性较为快速，但需要精密的仪器，较多的费用，因此不利于在抗性杂草发生地快速检测，而且并不是所有的抗性杂草在草甘膦处理后活性都增加，因此只适合于部分杂草的检测。检测靶标酶基因是否发生突变也可确认杂草对草甘膦的抗性，基因突变使得的结构发生变化，从而使其与底物的亲和力增加，杂草因此形成对草甘膦的抗性。由于不同抗性杂草基因突变位点不同，需要明确各种抗性杂草抗性突变位点才能充分利用分子生物学法检测杂草对草甘膦的抗性。在除草剂的生